TY  - THES
A1  - Bienko, Marzena
T1  - Ubiquitin regulation of DNA damage repair and tolerance
N2  - By adopting a variety of shapes, proteins can perform a wide number of functions in the cell, from being structural elements or enabling communication with the environment to performing complex enzymatic reactions needed to sustain metabolism. The number of proteins in the cell is limited by the number of genes encoding them. However, several mechanisms exist to increase the overall number of protein functions. One of them are post-translational modifications, i.e. covalent attachment of various molecules onto proteins. Ubiquitin was the first protein to be found to modify other proteins, and, faithful to its evocative name, it is involved in nearly all the activities of a cell. Ubiquitylation of proteins was believed for a long time only to be responsible for proteasomal degradation of modified proteins. However, with the discovery of various types of ubiquitylation, such as mono-, multiple- or poly-ubiquitylation, new functions of this post-translational modification emerged. Mono-ubiquitylation has been implicated in endocytosis, chromatin remodelling and DNA repair, while poly-ubiquitylation influences the half-life of proteins or modulates signal transduction pathways. DNA damage repair and tolerance are example of pathways extensively regulated by ubiquitylation. PCNA, a protein involved in nearly all types of DNA transaction, can undergo both mono- and poly-ubiquitylation. These modifications are believed to change the spectrum of proteins that interact with PCNA. Monoubiquitylation of PCNA is induced by stalling of replication forks when replicative polymerases (pols) encounter an obstacle, such as DNA damage or tight DNA-protein complexes. It is believed that monoubiquitylation of PCNA stimulates the exchange between replicative pols to one of polymerases that can synthesize DNA across various lesions, a mechanism of damage tolerance known as translesion synthesis (TLS). Our work has helped to understand why monoubiqutylation of PCNA favours this polymerase switch. We have identified two novel domains with the ability to bind Ub non-covalently. These domains are present in all the members of Y polymerases performing TLS, and were named Ub-binding zinc finger (UBZ) (in polη and polκ) and Ub-binding motif (UBM) (in polι and Rev1). We have shown that these domains enable Y polymerases to preferentially gain access to PCNA upon stalling of replication, when the action of translesion polymerases is required. While the region of direct interaction between Y pols and PCNA had been known (BRCT domain in Rev1 and PIP box motif (PIP) in three others members), we propose that Ub-binding domains (UBDs) in translesion Y pols enhance the PIP- or BRCT-domain-mediated interaction between these polymerases and PCNA by binding to the Ub moiety attached onto PCNA. Following these initial studies, we have also discovered that Y polymerases themselves undergo monoubiquitylation and that their UBDs mediate this modification. This auto-ubiquitylation is believed to lead to an intramolecular interaction between UBD and Ub attached in cis onto the UBD-containing protein. We have mapped monoubiquitylation sites in polη in the C-terminal portion of the protein containing the nuclear localization signal (NLS) and the PIP box. Beside PIP, the NLS motif is also involved in direct interaction of polη with PCNA. Based on these findings, we propose that monoubiquitylation of either NLS or PIP masks them from potential interaction with PCNA. Lastly, using several functional assays, we have demonstrated the importance of all these three motifs in the C-terminus of polη (UBZ, NLS and PIP) for efficient TLS. We have also constructed a mimic of monoubiquitylated polη by genetically fusing polη with Ub. Interestingly, this chimera is deficient in TLS as compared to the wild-type protein. Altogether, these studies demonstrate that the C-terminus of polη constitutes a regulatory module involved in multiple-site interaction with monoubiquitylated PCNA, and that monoubiquitylation of this region inhibits the interaction between polη and PCNA. Our work has also revealed that the UBDs of Y pols as well as of other proteins implicated in DNA damage repair and tolerance, such as the Werner helicase-interacting protein 1 (Wrnip1), are required for their proper sub-nuclear localization. All these proteins localize to discrete focal structures inside the nucleus and mutation of their UBDs results in inability to accumulate in these foci. Interestingly, by exchanging UBDs between different proteins we have learned that each UBD seems to have a distinct functional role, surprisingly not limited to Ubbinding ability. In fact, swapping the UBZ of Wrnip1 with the UBM of polι abolished the localization of Wrnip1 to foci despite preserving the Ub-binding ability of the chimeric protein. In summary, this work provides an overview of how post-translation modification of proteins by Ub can regulate several DNA transactions. Firstly, key regulators (e.g. PCNA) can be differentially modified by Ub. Secondly, specialized UBDs (e.g. UBM, UBZ) embedded only in a subset of proteins act as modules able to recognize these modifications. Thirdly, by means of mediating auto-ubiquitylation, UBDs can modulate the behaviour of host proteins by allowing for either in cis or in trans Ub-UBD interactions.
N2  - Als Träger der Erbinformation bedarf die DNA komplexer Mechanismen, um die auf ihr enthaltene Information zu bewahren. Zu jedem Zeitpunkt ist die DNA in einer Vielzahl von chemischen Reaktionen involviert, die häufig zu Mutationen führen. Als Folge solcher Prozesse wie die Hydrolyse oder Oxidation resultieren schätzungsweise 30000 Läsionen im Genom einer Zelle pro Tag. Eine Veränderung der Nukleotidsequenz kann folgenlos bleiben, kann aber auch zu gefährlichen Schäden führen. Aus darwinistischer Sicht stellt dies die Triebkraft der Evolution dar. Aus der Sicht eines Individuums und besonders im Falle mehrzelliger Organismen ist jedoch in der Regel jede Veränderung des Erbguts zu vermeiden. Folglich haben sich in mehrzelligen Organismen auf vielen Ebenen Mechanismen entwickelt, um Mutationen in der genetischen Information vorzubeugen. DNA-Reparaturmechanismen bestehen häufig in der Exzision eines geschädigten Fragments und dem anschließendem Ersatz mit intakten Nukleotiden. Die Wahl zwischen verschiedenen Reparaturprozessen hängt davon ab, in welcher Phase des Zellzyklus sich die Zelle befindet. In der S-Phase oder in G2 ermöglicht die Existenz zweier identischer DNA-Kopien in der Form von Schwesterchromatiden die Reparatur. Ist eines der beiden Schwesterchromatiden beschädigt, kann das intakte Chromatid als Vorlage dienen, um die auf dem geschädigten Fragment kodierte genetische Information wiederherzustellen. Falls jedoch das Schwesterchromatid nicht vorhanden ist, kann stattdessen die Information homologer Chromosomen ausgenutzt werden. Alternativ dazu können bei DNA-Brüchen die entsprechenden Stränge einfach wieder zusammengefügt werden. Um der DNA-Reparatur genug Zeit zu geben, haben sich Kontrollmechanismen entwickelt, um die Proliferation von Zellen, deren DNA geschädigt ist, vorübergehend anzuhalten oder zu verlangsamen. Diese Eigenschaft von Zellen ist an der Grenze zwischen der G1- und der S-Phase sowie während der Replikation von besonderer Bedeutung. Tatsächlich können Änderungen der ursprünglichen Nukleotidsequenz während der Replikation der DNA zur Weitergabe von Mutationen führen; um dies zu verhindern, sind spezielle Kontrollpunkte entstanden. Im Falle schwerwiegender Mutationen können derartig Kontrollmechanismen sogar den programmierten Zelltod der betroffenen Zellen einleiten, um dem Risiko zu entgehen, dass eine Mutation erhalten bleibt und durch Zellteilung weitergegeben wird. Aus der Sicht eines Individuums scheint es deshalb günstig, Zellen mit beschädigter DNA auf Kosten der genetischen Veränderbarkeit zu eliminieren. Nichtsdestotrotz haben Reparatur- und Kontrollmechanismen ihre Grenzen, weshalb geschädigte Stellen in der DNA bestehen bleiben können, wenn die Zelle in die S-Phase eintritt. Geschädigte DNA, die gerade repliziert wird, kann durch den intra-S-Phase Kontrollpunkt aufgespürt werden, wobei es entweder zur Unterbrechung der Replikation und anschließender Reparatur oder zur Apoptose kommt. In allen Reichen des Lebens besteht noch eine andere Möglichkeit mit beschädigter DNA zu verfahren, die DNA-Schadentoleranz genannt wird, und nach gegenwärtiger Auffassung eintritt, wenn Replikationsgabeln an geschädigten Abschnitten anhalten und dadurch den Fortgang der replikativen DNA Polymerasen (Pol) unterbrechen. Da die DNA während der Replikation schädigenden Reagenzien stärker ausgesetzt ist als in anderen Zellzyklusphasen, muss ihre Synthese und die Wiederausbildung des Chromatins so schnell wie möglich ablaufen. Dank DNA-Schadentoleranzmechanismen sind Zellen in der Lage, ihr gesamtes Genom trotz Vorhandenseins geschädigter Abschnitte zu replizieren. Auf diese Weise kann das Genom nach der Synthese durch Reparaturmechanismen repariert werden. Bei Toleranzmechansmen kann die Replikation geschädigter DNA fehlerfrei verlaufen. Dies geschieht, indem Nukleotide, die zur ursprünglichen Sequenz (= die Sequenz des Matrizenstrangs vor der Mutation) komplementär sind, eingebaut werden. Die Replikation mit Hilfe der Toleranzmechanismen kann aber auch zu Mutationen führen. Es gibt 3 Arten der DNA-Schadentoleranz; zwei nicht-mutagene und eine vorwiegend mutagene. Ist die Information eines intakten Schwesterchromatids vorhanden, um über eine Läsion hinweg zu replizieren, kann die ursprüngliche Nukleotidsequenz wiederhergestellt werden. Zwei nicht-mutagene Wege benützen die Information der Schwesterchromatide, um die Replikation geschädigter DNA zu bewerkstelligen: homologe Rekombination (HR) und ein ein Weg bei dem der Matritzenstrang ausgetauscht wird (template switch). Die homologe Rekombination ist der bervorzugte Weg, wenn die Replikation durch das Vorhandensein eines Bruches in einem oder beiden Strängen angehalten ist. Der genaue Vorgang des template switch ist dagegen immer noch unklar. Er ist der homologen Rekombination ähnlich, obgleich dabei die bei der klassischen homologen Rekombination beteiligten Proteinkomplexe nicht benötigt werden. Der dritte Weg der DNA-Schadentoleranz verwendet spezialisierte Polymerasen, die der Familie der sogenannten Y-DNA-Polymerasen angehören und sich dadurch auszeichnen, über geschädigte Abschnitte hinweg replizieren können; diesen Prozess bezeichnet man als DNA translesion synthesis (TLS). Mitglieder der Y Familie sind in der Lage, eine Vielzahl verschiedener DNA Läsionen in ihren katalytischen Bindungstaschen aufzunehmen und so Basen über diese hinweg einzubauen. Jede der vier Mitglieder der Y Familie (Polη, Polι, Polκ und Rev1) bevorzugt bestimmte Substrate. Zum Beispiel ist bekannt, dass Polη bevorzugt über Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere (CPD) repliziert. Obwohl während der Replikation geschädigter DNA relativ häufig falsche Basen eingefügt werden, hat Polη interessanterweise die Tendenz zwei Adenine gegenüber CPD einzufügen, wodurch die ursprüngliche genetische Information erhalten bleibt. Im Gegensatz dazu ist Polι diejenige unter den Y Polymerasen, die am häufigsten zu Mutationen führt. Diese geringe Präzision birgt jedoch einige Vorteile, da dadurch Polι sogar Nukleotide gegenüber abasischen Stellen einbauen kann. Interessanterweise folgen zwei der vier Mitglieder der Y Familie nicht der Regel der Watson-Crick Basenpaarung: Polι fügt Nukleotide gemäß der Hoogsteen Basenpaarung ein, während Rev1 Argininreste benutzt, um Kontakte mit ankommenden Nukleotiden herzustellen. Ein wichtiges Charakteristikum von Y Polymerasen stellt des Weiteren die im Gegensatz zu replikativen Polymerasen fehlende Korrekturleseaktivität dar. Diese Eigenschaft ermöglicht es, dass falsche Basenpaarungen bestehen bleiben, welche ansonsten im Falle replikativer Polymerasen durch ihre intrinsische Exonukleaseaktivität wieder entfernt werden würden. Außer der Familie der Y Polymerasen spielt auch eine Polymerase der B Familie (Polζ) eine wichtige Rolle bei der TLS. Diese verlängert für gewöhnlich DNA ausgehend von Läsionen, die zuvor von Y Polymerasen prozessiert wurden. Demnach werden zwei Polymerasen für eine effiziente TLS benötigt: eine, um Basen über geschädigte DNA hinweg einzufügen, die andere, um einige wenige Nukleotide hinter der Läsion anzufügen. Polζ besitzt alle Voraussetzungen, um DNA korrekt zu verlängern. Als Teil der B Familie arbeitet sie so exakt wie replikative Polymerasen, während ihr jedoch ebenso wie den Y Polymerasen die Fähigkeit fehlt, Korrektur zu lesen. Dies ermöglicht es ihr, über Stellen hinweg zu replizieren, die falsche Basenpaarungen aufweisen. Die Tatsache, dass es sich bei TLS um einen mutagenen Vorgang handelt, impliziert bereits, dass dieser streng reguliert sein muss. Die Replikation von unbeschädigter DNA durch die Familie der Y-Polymerasen wäre sehr schädlich, da dies zu einer Anhäufung von Mutationen führen würde. Deshalb ist es außerordentlich wichtig, dass die Zelle diese Enzyme nur verwendet, wenn es wirklich notwendig ist. Als Reaktion auf diese, nur eingeschränkt mögliche Nutzung, haben sich einige Regulationsmechanismen evolviert, um zu kontrollieren, wann und wie TLS aktiv ist. Rad6 z. B. ist ein Ubiquitin-konjugierendes Enzym, das, zusammen mit der E3-Ligase Rad18, ein Ubiquitinmolekül an PCNA heftet, sobald die Replikationsgabel blockiert ist. PCNA ist ein in Eukaryonten vorkommendes Protein, das die DNA umklammert und so als Plattform für DNA-Polymerasen dient, die auf diesem Weg an die DNA gebracht werden. Während eine durch Rad6/Rad18 bewirkte Monoubiquitinierung von PCNA TLS verursacht, katalysiert ein Komplex aus Rad6/Rad18 mit Ubc13-Mms2 (E2) und Rad5 (E3) die Verknüpfung von Polyubiquitinketten an PCNA. Dies führt dazu, dass zum Tochterstrang als Matrize gewechselt wird. In S. cerevisiae ist PCNA in der S-Phase ständig sumoyliert, was den Schadentoleranzmechanismus favorisiert und den Zugang von Komponenten der homologen Rekombination über die DNA-Helikase Srs2 verhindert. Es bleibt bisher unklar, wie der Modifikationstyp (Mono- oder Polyubiquitinierung oder Sumoylierung) ausgewählt und reguliert wird. Jedoch ist bekannt, dass in Zellen, die mit UV-Strahlen behandelt werden, PCNA hauptsächlich monoubiquitiniert vorliegt, was insofern Sinn ergibt, da Polη- abhängige TLS der Hauptweg ist, um über CPDs hinweg zu replizieren; derartige Dimere werden vor allem durch UV-Strahlung verursacht. Es ist aber nicht bekannt, wann PCNA bevorzugt polyubiquitiniert vorliegt und genauso wenig ist der Mechanismus bekannt, der den Matrizenaustausch gegenüber der TLS bevorzugt. Diese Arbeit hat dazu beigetragen zu klären, wie Monoubiquitinierung die TLS stimuliert. Unsere Gruppe hat zwei neue Arten von Ubiquitin-Bindedomänen (UBDs) entdeckt, die in allen Y-DNA-Polymerasen vorhanden sind und hat diese UBZ (Ubiquitin-binding Zinc-finger) und UBM (Ubiquitin-binding Motif) genannt. In Rev1 sind zwei UBM-Kopien vorhanden, während sich in der Polι eine einzige befindet. Polκ weist 2 UBZ Domänen auf, Polη hingegen nur eine. Mehrere Studien, u. a. eine von unserer Gruppe, konnten zeigen, dass diese Domänen eine spezifische Bindung zwischen Y-Polymerasen und monoubiquitiniertem PCNA besonders begünstigen. Die Monoubiquitinierung von PCNA wird durch die gegensätzlichen Aktivitäten ubiquitinierender (Rad6-Rad18) und deubiquitinierender (Usp1) Enzyme reguliert, wobei angenommen wird, dass die Stabilisierung der Monoubiquitinierung nur bei einer Blockierung der Replikation erfolgt. Demzufolge ist der Zugang der YDNA-Polymerasen sehr wahrscheinlich auf diese Situation beschränkt und ihre Aktivität wird somit bei einer fehlerfreien Replikation verhindert. Überraschenderweise konnten wir außerdem feststellen, dass die UBDs der Y-DNA-Polymerasen auch für die richtige subnukleäre Lokalisierung in Replikationsfoci während der S-Phase nötig sind. Solche Foci repräsentieren morphologisch die Replikationsfabriken, die in den Kernen der Zelle ausschließlich während der S-Phase zu sehen sind. Wir nehmen an, dass die UBDs der Y-DNA-Polymerasen in beschädigten Zellen außer dem Ubiquitin, das an PCNA gebunden ist, zusätzlich Ubiquitin oder ubiquitin-ähnliche Domänen innerhalb dieser Foci erkennen. Die Identität dieser Faktoren liegt jedoch noch im Dunkeln. Dass es nicht monoubiquitiniertes PCNA ist, das Y-DNA-Polymerasen an die Replikationsfoci rekrutiert, ist um so überraschender, wenn man Ergebnisse in Betracht zieht, die belegen, dass diese Polymerasen direkt mit PCNA interagiern müssen, um sich innerhalb dieser Replikationsfabriken anzusammeln. Alle Mitglieder der Familie der Y-DNA-Polymerasen beinhalten ein für die direkte Interaktion mit PCNA verantwortliches Motiv, das, wenn mutiert, die Ansammlung der Polymerasen in Foci verhindert. Im Fall von Rev1 bindet eine BRCT-Domäne PCNA, während alle anderen Polymerasen über ein PIP-box-Motiv die Bindung vermitteln. Wir konnten zusätzlich feststellen, dass neben den gut untersuchten PIP-box-Motiven, auch das angrenzende Kernlokalisationsignal (NLS) in Polη und Polκ mit PCNA interagieren. Aus diesem Grund haben wir die NLS-PIP-box-Region der Polymerasen eta und kappa PCNA-interagierende Regionen (PIR) genannt. Zusätzlich haben wir auch UBM- und UBZ-Domänen in anderen Proteinen, wie z.B. im Werner-Helikase-interagierenden-Protein-1 (Wrnip1), entdeckt. Wrnip1 trägt eine UBZ-Domäne und, ähnlich wie in Y-DNA-Polymerasen, ist die Lokalisation in Replikationsfoci UBD-abhängig. Im Gegensatz zu Y-DNA-Polymerasen befindet es sich auch außerhalb der S-Phase in fokalen Strukturen, deren Zusammensetzung jedoch noch nicht beschrieben wurde. Interessanterweise kann Wrnip1 sich aber in keiner fokalen Struktur innerhalb des Zellkerns akkumulieren, wenn die Fähigkeit Ubiquitin zu binden durch eine Mutation verloren gegangen ist; und dieses Phänomen hängt auch nicht von der Phase des Zellzyklus ab. Y-DNA-Polymerasen können ähnlich wie PCNA monoubiquitiniert werden. Im Gegensatz zu PCNA, dessen Affinität zu Polη durch Monoubiquitinierung verstärkt wird, blockiert jedoch die Monoubiquitinierung von Polη die Bindung an PCNA. Wir konnten feststellen, dass vier Lysinreste der Polη, die ubiquitiniert werden können, in ihrem PIR-Motiv liegen und dass die kovalente Bindung von Ubiquitin in dieser Region die Bildung eines pol eta-PCNA-Komplexes verhindert. Wenn man XPRO30-Zellen, die keine Polη besitzen, mit einer Polymerase rekonstituiert, die entweder Mutationen in der UBZ, der NLS oder der PIP-box aufweisen, kann die natürliche Reaktion auf UV-Strahlen in diesen Zellen nicht wieder hergestellt werden. Wenn die gleichen Zellen aber mit dem Wildtyp-Gen rekonstituiert werden, wird die ursprüngliche Verhaltensweise der Zellen bei UV-Strahlung wiederhergestellt. Zusätzlich verhält sich ein Fusionsprotein aus Polη und Ubiquitin ähnlich wie die zuvor genannten Mutanten. Zusammengefasst konnten wir in dieser Studie drei Motive in der Polη identifizieren, die nötig sind, damit die Polymerase in TLS richtig funktionieren kann und haben dabei einen komplexen Kontrollmechanismus dieses Prozesses, der durch Ubiquitin reguliert wird, aufgedeckt. Die UBD von Polη und möglicherweise anderen Y-DNA-Polymerasen ist notwendig, damit eine Interaktion mit monoubiquitiniertem PCNA stattfinden kann. Durch zwei weitere Sequenzen, der NLS und der PIP-box, kommt eine Bindungsspezifität zustande, indem diese PCNA direkt binden. Die NLS sowie die PIP-box sind dabei selbst Stellen, die monoubiquitiniert werden. Dieses Ereignis hat jedoch eine entgegengesetzte Auswirkung zur Monoubiquitinierung von PCNA, da es die Interaktion zwischen der Polη und PCNA verhindert. Diese Studie offenbart somit ein interessantes Beispiel dafür, wie Monoubiquitinierung die Zusammensetzung von Proteinkomplexen, je nachdem welches Substrat das Ziel der Ubiquitinierung ist, entweder positiv oder negativ regulieren kann.
Y1  - 2009
UR  - http://publikationen.ub.uni-frankfurt.de/frontdoor/index/index/docId/20436
UR  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hebis:30-86666
N1  - Enth. 3 Sonderabdr. aus verschiedenen Zeitschr. ; Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
CY  - Frankfurt am Main
ER  -