TY  - THES
A1  - Ibrahim, Mohamed
T1  - First insights into the phosphorylation of Toc34 proteins
N2  - The translocation of nuclear-encoded precursor proteins into chloroplasts is a highly ordered process involving the action of several components to regulate this molecular ensemble. Not only GTP hydrolysis and GDP release but also the phosphorylation of TOC GTPases is a widely discussed mechanism to regulate protein import.  The receptor component (Toc34) and its isoform of A. thaliana (atToc33) were found to be regulated by phosphorylation.  Although the phosphorylation of Toc33 is already known for several years, several questions regarding the molecular components involved in the regulation of the phosphorylation process, precisely what is the protein kinase and where this kinase is initially localized, so far remained unclear. 

This thesis aimed at the defining of the phosphorylation status of TOC GTPases in monomeric and/or dimeric states, the identification of the nature of Toc33-PK (protein kinase), and in the same context it aimed at gaining first insights into the physiological significance of Toc33 phosphorylation. To this end, (I) An in vitro and in vivo system for investigating of TOC GTPases Phosphorylation (in monomeric or dimeric state) was developed. Since no information is available about the phosphorylation status of the Toc159 isoforms, the second receptor of the TOC complex, it was interesting to investigate whether these isoforms undergo phosphorylation or not. The results indicated that atToc159 isoforms are able to be phosphorylated by the kinase activity in purified outer envelope membranes (OEMs) of pea, but not atToc132. Moreover, an artificial dimer of psToc34 based on the interaction of a C-terminally fused leucine zipper was not phosphorylated. This result reflected the inability of the OEM kinase to phosphorylate the dimers of TOC GTPases. Also, In vivo labeling of atToc33 was developed and occurred in a dose-dependent manner. Therefore, this results evidenced that in vitro phosphorylation of atToc33 (both endogenous wild type and recombinant expressed proteins) is not artificial labeling but represents a physiological relevance. CD (circular dichroism) measurements revealed that recombinant GTPase domain of atToc33 is preferentially phosphorylated in its folded state. Therefore, it could be suggested that folding of atToc33rec is a prerequisite for its phosphorylation and the phosphorylation event occurs as a posttranslational modification most likely after insertion of Toc33 (Toc34) into the OE of chloroplasts. 

Secondly, (II) Isolation and identification of Toc33-PK from OEMs of chloroplasts was performed. Four independent strategies were developed to identify the Toc33-protein kinase: UV-induced and chemically-based crosslinking, different applied chromatographic techniques, identification of PK-Toc33 interaction by means of HDN-PAGE (histidine- and deoxycholate-based native PAGE), and finally mass spectrometric approaches were performed on fractions including the potential kinase activity. UV-induced crosslinking procedure was developed and resulted in covalent bonding of nine proteins to [a-32P] ATP, while chemically-based one was not significant. The applied chromatographic and HDN-PAGE approaches, including mass spectrometry, have revealed the identification of 13 protein kinases. Of these identified kinases, phototropin2 (Phot2, AT5G58140), leucine-rich repeat PK (LRR-PK, AT4G28650.1), and receptor-like transmembrane PK (RLK, AT5G56040.2) were selected as the most promising candidates (ca. kinase type and one transmembrane helix for membrane localization).

(III) The physiological significance of Toc33 phosphoryation was shown to link this process with the environmental changes (especially, the light conditions). Identification of chloroplast OE-located PKs performed by nLC-MALDI-MS/MS resulted in the detection of Phot2. Furthermore, the subcellular localization of Phot2 in OEM of chloroplasts was confirmed by immunoblotting experiments using a-Phot2 antibody. The kinase activity of Phot2 towards TOC GTPases was characterized and revealed that fused GST-KD (kinase domain) protein able to specifically phosphorylate atToc33rec, but not atToc159rec. Also, endogenous atPhot2 was upregulated and heavily detected in the ppi1-S181A plant line (where serine to alanine exchange was performed to abolish the phosphorylation of atToc33). Hence, we suggested that certain signal cascades may directly or indirectly link Toc33 receptor phosphorylation, protein levels of Phot2 (as promising PK candidate), and irradiation conditions (as an inducing signal of the subsequent phosphorylation events). Light-dependent phosphorylation of Toc33 was shown either after de-etiolation conditions or after high light intensities of blue light was performed. Therefore, phosphorylation of Toc33 might be identified as an external regulatory signal to regulate preproteins import into chloroplasts in response to environmental conditions (e.g. light changes) or as a signal of chloroplast biogenesis.
N2  - Chloroplasten sind Organellen endosymbiotischen Ursprungs. Infolgedessen werden plastidäre Proteine von zytosolischen Ribosomen synthetisiert und anschließend zum Chloroplasten befördert, um hier über die Membranen transportiert zu werden. Der Gentransfer des Endosymbionten erforderte (1) die Bildung eines zytosolischen Zielsteuerungssystems, das zum einen aus einem Signal am zu transportierenden Protein besteht und zum anderen einer Maschinerie, welche dieses erkennt und zum Zielort führt. Sogenannte Führungskomplexe begleiten das Protein zur Chloroplastenoberfläche. Dort wird es von den Multiproteinkomplexen TOC und TIC (Translocon of the outer/inner envelope of chloroplasts) über beide Membranen transportiert. Für diesen Prozess ist ein Translokationssignal notwendig. Die Mehrheit der Präproteine weist eine N-terminale Verlängerung auf. Diese wird als Transitpeptid bezeichnet und dient der Erkennung durch den Führungskomplex sowie durch die Translokatoren. Sobald das Präprotein das Stroma erreicht, wird das Transitpeptid von einer stromalen Prozessierungspeptidase abgespalten. Eine Gruppe von Präproteinen wird durch Phosphorylierung/Dephosphorylierung am Transitpeptid reguliert. Hierbei bindet im phosphorylierten Zustand ein Führungskomplex, der sich aus dem Protein 14-3-3 und HSP70 zusammensetzt, an das Präprotein und wird anschließend von der Untereinheit Toc34 des TOC Komplexes in der äußeren Chloroplasten-membran erkannt. Toc34 ist der generelle Importrezeptor und nimmt auch Präproteine an, die von HSP90 an Toc64 übergeben wurden, einer Untereinheit, die dynamisch an den TOC Komplex assoziiert. Darüberhinaus erfordert der Gentransfer (2) die Entwicklung einer molekularen Maschine, die Proteine über die äußere als auch innere Chloroplastenmembran transportiert. Es wird angenommen, dass Toc75, die Pore des TOC Komplexes, für die Translokation des Präproteins zuständig ist. Während des Imports kommen die Translokatoren TOC und TIC durch Proteine im Intermembranraum und dem ATP-abhängigen Intermembranraum lokalisierten Chaperon HSP70 in räumliche Nähe. Schließlich gelangt das Präprotein durch den Importkanal des TIC Komplexes. Der Prozess wird durch stromale Chaperone abgeschlossen: HSP93 liefert die Energie durch ATP Hydrolyse, während HSP60 und HSP90 für die Faltung des Proteins zuständig sind. Das mature Protein liegt nach Abspaltung des Transitpeptids vor.
Eine weitere Notwendigkeit ist (3) ein Regulationssystem zur Kontrolle des Gesamtprozesses. Die Führung des Präproteins zum Chloroplasten und dessen Import sind aufeinander abgestimmte Vorgänge, die auf GTP-abhängige Abläufe am TOC Komplex beruhen und auf dem Zusammenwirken von Proteinkinasen und -phosphatasen sowie anderen Faktoren basieren. Phosphorylierung und GTP Hydrolyse sind an der Regulation beteiligt und sichern den geregelten Ablauf. Die Phosphorylierung von Toc34 und wahrscheinlich auch Toc159 reguliert die Rezeptor-aktivität. Über die Funktion der Phorphorylierung von Toc159 stehen kaum Information zur Verfügung. Bekannt ist, dass die jeweilige G-Domäne der TOC Rezeptoren von unterschiedlichen Kinasen phosphoryliert wird, doch ihre molekulare Identifizierung steht noch aus. Durch die Phosphorylierung von Toc34 wird die Erkennung von Präproteinen und die Homodimerisierung, d.h. die Interaktion der G-Domänen zweier Toc34 Rezeptoren, verhindert, was zu deren Dissoziation führt. Darüberhinaus wird die Bindung von GTP inhibiert. Toc34 im GTP gebundenen Zustand kann nicht phosphoryliert werden. Die Dephosphorylierung wird von einer ATP-abhängigen Phosphatase katalysiert. Interessanterweise wurden in A. thaliana zwei Isoformen von Toc34 identifiziert (atToc34 und atToc33). Es wird angenommen, dass sich beide Isoformen in ihrer Funktion unterscheiden. AtToc33 soll am Import von photosynthetischen Proteinen beteiligt sein, während atToc34 für die Translokation von sogenannten housekeeping Proteinen benötigt wird. Beim Vergleich von psToc34 aus P. sativum mit atToc33 und atToc34 aus A. thaliana stellt sich heraus, dass lediglich atToc33 phosphoryliert werden kann. Außerdem liegen Unterschiede bezüglich der Phosphorylierungsstelle vor. In psToc34 wird der Serin-Rest 113 modifiziert und in atToc33 der Serin-Rest 181. Bis jetzt ist nicht bekannt, wann die TOC Rezeptoren phosphoryliert werden und in welchem Faltungszustand die GTPasen zu diesem Zeitpunkt vorliegen. Um die Phosphorylierung im physiologischen Kontext zu verstehen, muss eine Toc spezifische Phosphokinase (TOC-PK) identifiziert und untersucht werden.
Die Phosphorylierung stellt die wichtigste posttranslationale Modifikation von Proteinen dar. Das γ-Phosphat des ATP wird dabei von Enzymen, die Kinasen genannt werden, auf das Zielprotein übertragen. Die Dephosphorylierung wird hingegen von Phosphoprotein-Phosphatasen durchgeführt. Man geht davon aus, dass ein Drittel aller eukaryotischer Proteine durch reversible Phosphorylierung reguliert wird und, dass schätzungsweise 1-3 % der funktionalen Gene des Eukaryonten Phoshokinasen (PK) codieren. Daher spielt die Phosphorylierung eine fundamentale Rolle in der Regulation mehrerer zellulärer Prozesse vor allem in der Signaltransduktion. Das Genom von A. thaliana kodiert insgesamt 989 PK, von denen 45 im Chloroplasten lokalisiert sein sollen. Überraschenderweise sind nur 7 chloroplastidäre PK (cpPK) an der reversiblen Phosphorylierung von Chloroplastenproteinen beteiligt. Eukaryotische PK werden in zwei Gruppen unterteilt. Dabei richtet sich die Klassifizierung nach dem Aminosäurerest, auf welchen der Phosphatrest übertragen wird. Ist der Phosphatakzeptor ein Serin (Ser) oder Threonin (Thr), spricht man von Serin/Threonin-Kinasen (1). Wird hingegen die Aminosäure Tyrosin phosphoryliert, ist von Tyrosinkinasen (2) die Rede. PK, die Serin und/oder Threonin sowie Tyrosin zur Übertragung verwenden, werden als dualspezifische Kinasen bezeichnet. Basierend auf Sequenzvergleichen und phylogenetischen Analysen der konservierten PK Domänen wurde die Superfamilie der dualspezifischen Kinasen in fünf Hauptgruppen gegliedert. Die Kinasedomäne der konventionellen eukaryotischen PK besteht aus einer konservierten 250-300 Aminosäuresequenz, welche in zwölf konservierten Subdomänen (SD) angeordnet vorliegt (I-V, VIA, VIB und VII-XI). Einige dieser SD weisen konservierte AS auf, die für die Stabilität und Funktion des Enzyms essentiell sind. So. sind z.B. die SD I-IV für die ATP Bindung notwendig und SD V fungiert als Linker, während die SD VIA-XI das katalytische Zentrum bilden. Der Hauptfokus dieser Studie liegt auf der Phosphorylierung von Toc33, welches eine wichtige Rolle bei der Regulation des TOC Komplexes einzunehmen scheint. Diesbezüglich sind viele Fragen offen. Beispielsweise ist nichts über die Eigenschaften der entsprechenden Kinase(n) bekannt und auch die physiologische Relevanz der Modifikation bleibt ungeklärt. Um die Bedeutung und die Folgen der Phosphorylierung im Gesamtgefüge zu verstehen, wurden, basierend auf in vivo und in vitro Untersuchungen mit der rekombinant exprimierten G-Domäne von Toc33, biochemische und biophysikalische Methoden etabliert und entwickelt.
Der Serin-Rest 181 von atToc33 befindet sich inmitten einer schwer zugänglichen α-Helix, was die Frage aufwirft, ob die Phosphorylierung vor oder nach Insertion in die äußere Chloroplastenmembran stattfindet. Außerdem soll herausgefunden werden, wo die TOC spezifische Kinase lokalisiert ist, ob sie den Homodimer und/oder den Monomer von psToc34 als Substrat erkennt, welche Bedingungen für die optimale Aktivität vorliegen müssen und welchen Einfluss die Lichtintensität auf die Phosphorylierung von Toc33 in vivo und in vitro hat. Diese Fragestellungen wurden mittels Zellfraktionierung, chromatographischen und massenspektrometrischen Ansätzen sowie mit Hilfe von nativer Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass beide TOC GTPasen, Toc33 und Toc159 sowie zwei der drei Toc159 Isoformen (atToc120 und atToc90), in monomerer Form in vitro phosphoryliert werden. Dies trifft jedoch nicht auf den rekombinanten psToc34 Homodimer zu. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Toc12, Oep37, Oep21 sowie cHSP60 als Phosphoproteine in der äußeren Chloroplastenmembran vorliegen. Den Untersuchungen nach ist hier auch die TOC spezifische Kinase lokalisiert, deren pH Optimum bei 7.5 liegt. Des Weiteren weist das Enzym eine bemerkenswerte Spezifität für bestimmte Metallionen auf, wird kompetitiv von Pyrophosphat inhibiert und phosphoryliert atToc33 im gefalteten Zustand. Zur Identifikation der Toc33-PK wurden mehrere Strategien verfolgt. Unter anderem eine Methode, bei der [α-32P] ATP durch UV-Licht an aufgereinigte outer envelopes (OEs) kovalent gebunden wird. Die Resultate dieses Versuchs erbrachten neun putative [α-32P] ATP bindende Proteine, welche Molekulargewichte von 29 bis 116 kDa aufweisen. Im Gegensatz dazu erbrachte eine auf chemischer Kopplung („crosslinking“) basierte Versuchsanordnung keine Ergebnisse. Jedoch konnten durch native Gelelektrophorese (HDN-PAGE) in Kombination mit Massenspektrometrie 13 weitere Kandidaten für die Phosphorylierung von Toc33 gefunden werden. Unter Beachtung zweier Hauptkriterien (Besitz eines Ser/Thr-Kinase Domäne und mindestens einer Transmembranhelix) wurden Phot2 (AT5G58140.2), LRR-PK (AT4G28650.1) und RLK (AT5G56040.2) als die vielversprechendsten Kandidaten ausgewählt und weiteren Untersuchungen unterzogen.
Der immunologische Nachweis von Phot2 diente zur Bestätigung der subzellulären Lokalisation in der äußeren Chloroplastenmembran. Darüber hinaus konnte mit Hilfe eines Fusionskonstrukts aus der atPhot2-Kinasedomäne und einem N-terminalen GST-Tag eine signifikante Phosphorylierung von atToc33 nicht jedoch von atToc159 gezeigt werden. Die Analyse von endogenem atPhot2 erfolgte unter Verwendung von A. thaliana Wildtyp Pflanzen sowie durch komplementierte KO-attoc33 Pflanzenlinien, welche einen Serin zu Alanin Austausch an der Phosphorylierungsstelle trugen. Diese ppi1-S181A Pflanzen zeigten eine deutlich erhöhte atPhot2 Expression im Vergleich zum Wildtyp in gemischten chloroplastidären Hüllmembranen sowie im Gesamtmembranproteinextrakt. Eine direkte oder auch indirekte Interaktion über eine Phosphorylierungskaskade von Phot2 und Toc33 ist demnach wahrscheinlich.
Phänotypische Analysen in vivo von A. thaliana Wildtyp Pflanzen sowie KO-attoc33 (ppi1), ppi1-S181A und ppi1-S181E (der Austausch von Serin zu Glutamat an der Phosphorylierungsposition soll eine Phosphorylierung an dieser für die Regulation des Proteins kritischen Stelle vortäuschen) sollten den Regulationsmechanismus von Toc33/34 durch Phosphorylierung in einen physiologischen Kontext setzen. Eine erhöhte Phosphorylierungsrate von atTo33 und psToc34 war die Folge von Weißlichtbestrahlung und Entwicklungsstand der Pflanzen. Darüber hinaus konnte eine Verstärkung der Phosphorylierung von rekombinantem atToc33 durch Blaulicht gegenüber Weißlicht nachgewiesen werden. Die Resultate dieser Arbeit unterstützen und vertiefen die Hypothese, dass die Phosphorylierung von Toc33/34 einen Regulationsmechanismus des Proteinimports in den Chloroplasten darstellt. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen darüber hinaus, dass dieser Regulationsmechanismus durch Umwelteinflüsse wie z.B. Licht gesteuert werden kann. Die Implikation des Blaulichtrezeptors Phot2, der den Phosphorylierungsgrad von Toc33/34 beeinflusst, ist ein Indiz dafür. Ob die Interaktion direkt oder über eine Signalkaskade erfolgt und wie sie sich in die intrazellulären Kommunikationssysteme eingliedert, bleibt jedoch unklar und stellt die Grundlage für weiterführende Studien auf diesem Gebiet dar.
Y1  - 2012
UR  - http://publikationen.ub.uni-frankfurt.de/frontdoor/index/index/docId/24626
UR  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hebis:30:3-246262
N1  - Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
ER  -