Rolle der Epoxyeicosatriensäuren in der Modulation des Agonisten-induzierten Kalziumeinstroms in humanen Endothelzellen

Seit den ersten Berichten über renale CYP-Enzyme, die den arteriellen Tonus beeinflussen können, steht die entscheidende Rolle der CYP-Epoxygenasen in der Modulation der vaskulären Homöostase außer Frage. Die Verbindung 
Seit den ersten Berichten über renale CYP-Enzyme, die den arteriellen Tonus beeinflussen können, steht die entscheidende Rolle der CYP-Epoxygenasen in der Modulation der vaskulären Homöostase außer Frage. Die Verbindung zwischen CYP-Expression und kardiovaskulären Erkrankungen ist jedoch noch mit Vorbehalt zu betrachten. Dennoch kann ihre Bedeutung in der Pathogenese der Hypertonie und Atherosklerose nicht länger ignoriert werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war der Nachweis, inwieweit endogen-gebildete EET an der Regulation des Agonisteninduzierten Kalziumeinstroms in nicht-erregbaren Endothelzellen beteiligt sind. Da es in kultivierten Endothelzellen im Gegensatz zu nativen Endothelzellen zu einer rapiden Reduktion der CYP 2C-Expression kommt, wurde die Expression von CYP 2C zu einem durch die Verwendung eines adenoviral-vermittelten Überexpressionssystems und zum anderen durch Nifedipin induziert. Zunächst führte die Stimulation mit Bradykinin in kultivierten Endothelzellen, die infolge der Kultivierung das CYP 2C-Protein nicht mehr exprimieren, zu einem Kalziumeinstrom. Dieser Effekt wurde weder von Sulfaphenazol, einem spezifischen CYP 2C9-Hemmer, noch von ACU, einem Hemmer der sEH, beeinflusst. Dahingegen führte die Hemmung der sEH durch ACU in CYP 2C-exprimierenden Endothelzellen zu einem signifikanten Anstieg der Plateauphase des Bradykinininduzierten Kalziumeinstroms. Dieser Effekt konnte sowohl durch Sulfaphenazol als auch durch 14,15-EEZE, einen EET-Antagonisten, aufgehoben werden. Die Kontrollzellen wurden weder von den Substanzen alleine noch in Kombination mit ACU beeinflusst. Die Verwendung von DCU, einem weiteren spezifischen Hemmer der sEH, führte ebenfalls zu einem signifikanten Anstieg der Plateauphase des Bradykinin-induzierten Kalziumeinstroms in CYP 2C-exprimierenden Endothelzellen im Vergleich zu den Kontrollzellen. Die Hypothese der sEH-Hemmer als potente Modulatoren des EET-vermittelten Kalziumeinstroms wurde weiterhin durch den Befund belegt, dass die Inkubation mit dem mEH-Hemmer Elaidamid keinen Einfluss auf die Höhe des Bradykinin-induzierten Kalziumplateaus hatte. Durch die Untersuchungen in An- und Abwesenheit von extrazellulärem Kalzium konnte gezeigt werden, dass endogen-gebildete EET die [Ca2+]i durch Verstärkung des kapazitiven Kalziumeinstroms beeinflussen. Die Aufhebung der Effekte durch den PKA-Hemmer Rp-cAMPs lässt auf eine Rolle der PKA schließen, der Signaltransduktionsweg bleibt zu klären. Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse in isolierten endothelintakten Umbilikalvenen belegt die physiologische Relevanz. In der vorliegenden Studie konnte die Bedeutung der EET in der Regulation des kapazitiven Kalziumeinstroms und der sEH-Hemmer als potente Modulatoren der biologischen Aktivität von EET demonstriert werden. Die Eingliederung in den Kontext der vaskulären Homöostase und der Pathogenese von kardiovaskulären Erkrankungen bleibt hochinteressant und zukunftsweisend.
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Since the initial reports that renal cytochrome P450 (CYP) enzymes metabolize arachidonic acid to substances which affect arterial tone, the evidence that CYP enzymes play a crucial role in the modulation of vascular hom
Since the initial reports that renal cytochrome P450 (CYP) enzymes metabolize arachidonic acid to substances which affect arterial tone, the evidence that CYP enzymes play a crucial role in the modulation of vascular homeostasis has steadily increased. Although the link between CYP expression and cardiovascular disease is currently tentative, numerous studies have suggested that CYP-dependent pathways are altered in animal models of hypertension and atherosclerosis. As the intracellular Ca2+ concentration is important for the regulation of vascular tone as well as proliferation, the aim of the present study was to address the role of CYP-derived epoxyeicosatrienoic acids (EET) in the regulation of agonist-induced Ca2+ signaling in endothelial cells. A confounding problem has been that although endothelial cells in situ express CYP 2C epoxygenase protein, expression levels decrease rapidly following cell isolation and culture. Therefore, it was necessary to study CYP-dependent signaling in endothelial cells using a combination of either CYP 2C induction with nifedipine or adenoviral overexpression of CYP 2C9. Both approaches resulted in an enhanced capacitive Ca2+ entry into endothelial cells in response to agonist stimulation (bradykinin). The effects were pronounced in cells treated with inhibitors of the soluble epoxide hydrolase (sEH; the enzyme that metabolises EET to their less active DHET) and were inhibited by the CYP 2C9 inhibitor sulfaphenazole as well as by the EET antagonist, 14,15-EEZE. The microsomal epoxide hydrolase inhibitor, elaidamid, had no influence on the bradykinin-induced Ca2+ influx into endothelial cells. Furthermore, experiments in presence and absence of extracellular Ca2+ supported the finding that endogenously generated EET regulate the capacitative Ca2+ entry and have no significant influence on the release of Ca2+ from intracellular stores. The effects of the EET did not appear to be direct as the CYP-dependent increase in Ca2+ entry was not observed in cells treated with the protein kinase A inhibitor RpcAMPs, however further investigation into the exact molecular mechanisms involved is required. The physiological relevance of the observations made was underlined by the observation that in endothelium-intact umbilical veins, which express CYP 2C protein, inhibition of the sEH also augmented the bradykinin-induced capacitive Ca2+ influx. Taken together, the results of the present study demonstrate the importance of EET in the regulation of the capacitative Ca2+ influx. The integration in the context of vascular homeostasis and pathogenesis of cardiovascular diseases remains exciting and pivotal.
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Metadaten
Author:Anna Lena Sander
URN:urn:nbn:de:hebis:30-53851
Referee:Rudi Busse
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2011/03/24
Year of first Publication:2007
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2007/10/31
Release Date:2011/03/24
HeBIS PPN:246213051
Institutes:Medizin
Dewey Decimal Classification:610 Medizin und Gesundheit
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

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