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Stefanie-Yvonne Zimmermann

• Zelluläre Zytotoxizität ist ein Phänomen, das für die Wirkung allogener Stammzelltransplantationen verantwortlich gemacht wird. Sie wird zudem genutzt im Rahmen zellulärer Immuntherapien mit Spenderlymphozyten, angereicherten, aktivierten und z.T. gentechnisch veränderten T- und NK-Zellen, Targeting der Antitumor-Immunantwort mit bispezifischen Antikörpern und der Vakzinierung mit dendritischen Zellen. Ihre Messung ist von großer Bedeutung bei der Weiterentwicklung und Validierung solcher Verfahren. In der Klinik für Kinderheilkunde und Jugendmedizin der Johann Wolfgang Goethe-Universität werden gegenwärtig mehrere solcher Verfahren entwickelt und eingesetzt. Eine Zytotoxizitätsmessung insbesondere gegen patienteneigene Leukämieblasten ist daher unerlässlich. Proben von Leukämieblasten aus peripherem Blut oder Knochenmark von Patienten sind heterogen und enthalten in der Regel restliche gesunde Zellen. Diese Zellen verzerren die Messung einer spezifischen Zytotoxizität gegen die Blasten, wenn sie nicht gezielt aus der Auswertung ausgeschlossen werden. Effektorzellen bestehen ebenfalls aus Subpopulationen, die in unterschiedlichem Ausmaß mit den Blasten interagieren. Um solche komplexen Proben adäquat analysieren zu können, sollte ein durchflusszytometrischer Assay unter Ausnutzung des Potenzials monoklonaler Antikörper zur differenziellen Markierung von Zellpopulationen entwickelt werden. Die Auswertung der Leukämietypisierungen von 47 Patienten und Austestung in Frage kommender Antikörper ergab, dass eine Wahl der Antikörper aufgrund des immunologischen Subtyps einer Leukämie nur mit Einschränkung möglich ist, so dass eine Vorabtestung der Antikörper erfolgen muss. Bei Einsatz der Markierung von Proben mit FITC- und PEkonjugierten Antikörper in einem konventionellen durchflusszytometrischen Assay, der die PI positiven Zielzellen an den Gesamtzielzellen als Korrelat der zytotoxischen Aktivität der Effektorzellen maß, traten Diskrepanzen in den Anteilen der Zellpopulationen einer Probe auf. Diese legten den Schluss nahe, dass tote Zellen durch vollständige Fragmentierung einer Messung entgehen. In einer neu konzipierten Assayvariante wurde daher das gegenteilige Konzept gewählt, die Messung des Überlebens der Zellen. Dies wurde ermöglicht durch die Einführung eines internen Standards, der eine durchflusszytometrische Konzentrationsmessung erlaubt. Mit diesem Verfahren wurde gezeigt, dass die Zunahme der mit PI erfassten toten Zellen nur gering mit der Abnahme lebender Zellen korreliert. Die Validierung anhand des Europium-Release-Assays ergab übereinstimmende Ergebnisse dieser zweiten Assayform mit diesem bei signifikantem (P ≤ 0,01, Wilcoxon-Rangtest) Unterschied der ersten Variante. Der im Rahmen dieser Doktorarbeit entwickelte Assay erlaubte zusätzlich die Beurteilung auch des Verhaltens der Effektorzellkonzentrationen. Es wurde gezeigt, dass diese sich bei vorhandener zytotoxischer Aktivität gegen die Zielzellen änderten im Sinne einer initialen Abnahme insbesondere in den geringen Effektor:Zielzell-Ratien und einer erneuten Zunahme bei längerer Kokulturdauer im Sinne einer Proliferationsinduktion durch den Zielzellstimulus. In einem letzten Schritt wurde eine modifizierte Zytometersteuerung und die Markierung CD4 und CD8 positiver T-Zellen in der gleichen Fluoreszenz unter Ausnutzung der unterschiedlichen Fluoreszenzintensitäten eingeführt. Dadurch wurde es möglich, bei vier Fluoreszenzbereichen simultan bis zu fünf verschiedene monoklonale Antikörper zuzüglich Propidiumjodid in einem einzigen Ansatz zu verwenden und so nicht nur lebende Ziel- und Effektorzellen zu differenzieren, sondern durch entsprechende Kombination der Antikörper auch Effektorzellsubpopulationen wie CD4+ und CD8+ T-Zellen in ihrem Verhalten zu beurteilen. Über die gleichzeitige Auswertung von Ziel- und Effektorzellen in verschiedenen Effektor:Zielzell-Ratien erlaubt dieser neue Assay differenzierte Aussagen über das Verhalten und die Reaktivität von Zellen in Kokultur bei einfacher Handhabung, minimaler Zellmanipulation im Verlauf des Assays durch Markierung erst nach Kokultur und hoher Flexibilität in der bearbeiteten Fragestellung.
• Cytotoxic activity of T- and NK-cells is thought to be the mechanism underlying the graftversus-leukemia effect in allogeneic hemopoetic stem cell transplantation. It is exploited in immunotherapy with donor lymphocyte infusions. Currently, efforts are under way to propagate the effectiveness and safety of cellular immunotherapy by enrichment, activation or genetic modification of immunocompetent cells. These approaches comprise application of allogeneic suicide gene transduced donor T cells, retargeting of Fc&#947;-receptor bearing cells by bispecific antibodies or transduction of tumor specific activating receptors as well as autologous dendritic cell vaccines for T cell activation. To validate such strategies and test their efficacy against patient malignant cells, assessing the cytotoxic activity of the manipulated putative effector cells is crucial. Samples of leukemic blasts can be heterogenous and contain normal lymphocytes or bone marrow cells, mounting up to > 50% of cells. If not excluded from analysis, these cells may distort results obtained from cytotoxicity assays. Effector cells themselves can be inhomogenous, including subpopulations both reactive or anergic to the target cells employed. To assess cell lysis using these complex samples in the setting of immunotherapy, a suitable cytotoxicity assay was needed. Exploiting the potential of monoclonal antibodies (mAb) to distinguish cells by their surface marker expression and propidium iodide (PI) as a marker of dead cells, in this work a four color-flow cytometric cytotoxicity assay was developed. Screening the leukemic cells from 47 children showed that mAb distinctly marking the populations of a coculture of effector cells and patient malignant target cells cannot be selected according to the subtype of leukemia alone, due to variations in fluorescence intensities yielded. Consequently, preselected antibodies were tested for their capacity to differentially mark the blasts and effectors in each case. Based on the concept of the majority of flow cytometric assays proposed in literature, in a first assay variant dead target cells were measured as percent of all target cells. Cell populations were distinguished by two mAb, conjugated with FITC and PE fluorescent molecules, respectively. In a series of assays using cryopreserved blasts as target cells, discrepancies between the proportions of cells expected in a sample and those actually detected became obvious, with an overall decrease of target cell percentage. It was concluded that dead cells escaped detection by dissolving completely. Additionally, changes in scatter and mAb binding properties of dead cells hampered consistent and precise gating. Therefore, in the opposite approach, the loss of vital cell concentrations of cocultures relative to the controls was calculated. Flow-Count beads were used as internal standard to concomitantly measure cell concentrations and proportions within a flow cytometric sample. PI staining served as an exclusion criterion. Comparison of the results of a series of assays calculated with either method showed a loose correlation, only. The results from the europium release assay agreed with the results obtained from calculating vital cell loss while differing significantly from the proportion of dead cells measured, which were lower (p < 0,01, Wilcoxon´s rank test). This finding supported the hypothesis of loss of dead cells from detection. In addition to measuring cytotoxic activity, the newly developed assay also allowed for assessing the changes in effector cell concentrations. These were shown to correspond to target cell lysis, with an initial loss of effectors through conjugate formation and induction of proliferation after a prolonged period of stimulation with target cells. By contrast, when no target cell lysis occurred, effector concentrations remained unchanged, as well. In a third step of development, modifications of the cytometer controls made the use of antibodies conjugated to four different fluorochromes possible while detecting and excluding PI stained cells from analysis by the uncompensated signal of PI. Moreover, T-helper and cytotoxic Tcell subsets were distinguished by their different fluorescence intensities simultaneously employing PC5 conjugated monoclonal antibodies both against CD4 and CD8. These combined strategies allowed for the use of up to five monoclonal antibodies and PI within one sample, offering the possibility to measure activation or transduction markers. To conclude, concomitantly calculating changes in both target and effector cell concentration, this newly developed highly flexible cytotoxicity assay yields a maximum of information on reactivity and interactions of cells in combination with minimal manipulation of the samples by marking cells after coculture, only.