Untersuchungen zur Steigerung der rekombinanten Expression von FVIII auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene

Investigation on the improvement of recombinant expression of coagulation factor VIII at the transcriptional and posttranscriptional level

Der Mangel von Faktor VIII (FVIII) führt zur häufigsten Gerinnungsstörung, der Hämophilie A. Die rekombinante Expression von FVIII für gentherapeutische Ansätze oder zur Herstellung von FVIII ist zwei bis drei Größenordn
Der Mangel von Faktor VIII (FVIII) führt zur häufigsten Gerinnungsstörung, der Hämophilie A. Die rekombinante Expression von FVIII für gentherapeutische Ansätze oder zur Herstellung von FVIII ist zwei bis drei Größenordnungen niedriger verglichen mit anderen Proteinen vergleichbarer Größe. Die Ursachen für die geringe Expression liegen zum großen Teil an der ineffizienten Transkription und dem ineffizientem intrazellulären Transport. (1) Im Rahmen der Untersuchung der FVIII-Sekretion, konnte durch Verwendung von FVIII-GFP Fusionsproteinen zum ersten Mal gezeigt werden, wie FVIII in lebenden Zellen transportiert wird. Außerdem wurde anhand von vergleichenden Immunfluoreszensfärbungen, FVIII-Messungen und Westernblotanalysen demonstriert, dass weder bei der B-Domäne deletierten noch bei der Volllängenvariante signifikante Unterschiede zwischen den GFP-fusionierten und Wildtyp-FVIII-Varianten messbar waren. Offensichtlich wird die Funktionalität von FVIII durch die C-terminal fusionierte GFP-Domäne nicht eingeschränkt. In ersten Lebendzellanalysen konnte gezeigt werden, dass sich FVIII in primären Zellen und Zelllinien hauptsächlich im ER befindet und eine für lumenale ER-Proteine charakteristischen Mobilität aufweist. Beim frühen sekretorischen Transport zeigte sich bei Temperaturblock-Experimenten eine verlängerte Dauer der Akkumulation in ER-Exit-Sites und eine vergleichsweise niedrige Frequenz von ER-Golgi-Bewegungen. Es konnte zum ersten Mal der Nachweis von FVIII-Transport durch vesikuläre tubuläre Cluster erbracht werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der möglicherweise durch Faltungsprobleme blockierte Austritt aus dem ER das Hauptproblem des ineffizienten FVIII-Transports zu sein scheint und weniger der intrazelluläre Transport an sich. Mittels siRNA-Silencing wurde außerdem die überwiegende Beteiligung von COPI am intrazellulären Transport von FVIII deutlich, dessen Herunterregulierung zu einer 78 prozentigen Reduktion der FVIII-Sekretion im Gegensatz zu 32 Prozent bei COPII führte. Dagegen konnte durch Herunterregulierung der Expression der p24-Cargo-Rezeptor Familienmitglieder p24 und p26 und der Clathrin Adapterproteine µ- und -Adaptin bzw. durch physiologischen Knock-out im Falle von ER-Exit-Rezeptor MCFD2 kein Einfluß auf die FVIII-Sekretion festgestellt werden. (2) Als Alternative zu dem ineffizienten FVIII-Expressionsystem in unphysiologischen Zelllinien, bieten primäre Endothelzellen den Vorteil einer hocheffizienten FVIII-Sekretion. Zur Verwendung bei der rekombinanten Produktion benötigt man allerdings eine kontinuierlich wachsende gut charakterisierte Zelllinie. Zur Immortalisierung wurden aus Nabelschnurblut gewonnene Endothelprogenitorzellen mit der aktiven Untereinheit der humanen Telomerase (hTERT) transduziert. Trotz erfolgreicher Transduktion und langfristiger Expression von hTERT, welche im TRAP-Assay normale Aktivität zeigte, gingen die Zellen nach der natürlichen Teilungsspanne in die Seneszenz über. Möglicherweise wird noch ein weiteres Immortalisierungsgen benötigt oder hTERT ist durch die ektopischen Expression in diesen Endothelzellen nicht funktionell. (3) Der Einsatz hämatopoetischer Stammzellen für gentherapeutische Ansätze zur Expression von humanen FVIII ist bislang aufgrund niedriger Expressionseffizienz der Vektoren limitiert. Es wurden daher die Kombinationen verschiedener transkriptioneller und posttranskriptioneller Elemente in FVIII-Expressionsvektoren ausgetestet. Hierbei zeigte sich, dass die Verwendung einer 5’ untranslatierten Region (5’UTR) des hämatopoetisch exprimierten FXIIIA-Gens die FVIII-Sekretion in verschiedenen Zelllinien und primären Zellen deutlich steigerte. Am stärksten war die Wirkung in primären Monozyten, in denen die FVIII-Expression den 6fachen Wert im Vergleich zum Ursprungsvektor ohne 5’UTR erreichte. Leberzellen stellen weitere attraktive Zielzellen für gentherapeutische Ansätze dar, da Sie den primären physiologischen Ort der FVIII-Synthese darstellen. Die häufig für Gentherapievektoren verwendeten ubiquitär exprimierenden viralen Promotoren bewirken zwar hohe Expression in den transduzierten Zellen, haben allerdings den Nachteil durch ektopische Expression vermehrt Immunantworten auszulösen und durch starke Interaktion mit benachbarten Promotoren der Integrationsstelle im Genom möglicherweise tumorgene Effekte zu verursachen. Bei der Untersuchung verschiedener physiologischer Promotoren im Vergleich zum viralen CMV Promotor in Leberzellen konnte mit dem zum ersten mal getesteten minimalen FVIII-Promoter in einem lentiviralen Vektor der dritten Generation in Leberzelllinien eine vergleichsweise hohe Expression von 0,5 IU/ml FVIII /106 Zellen erzielt werden. Der FVIII-Promoter ist daher geeignet für eine lebergerichtete Expression und minimiert dabei das potentielle Risiko der häufig verwendeten ubiquitären viralen Promotoren.
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The lack of factor VIII (FVIII) leads to the most common bleeding disorder, hemophilia A. The expression of FVIII for recombinant production or gene therapeutic approaches is two to three orders of magnitude lower compar
The lack of factor VIII (FVIII) leads to the most common bleeding disorder, hemophilia A. The expression of FVIII for recombinant production or gene therapeutic approaches is two to three orders of magnitude lower compared to other proteins of comparable size. The causes for the low expression are largely due to inefficient transcription and inefficient intracellular transport. (1) FVIII secretion was analysed using green fluorescent protein fused to the C-terminus of B-domain deleted and full length FVIII. With these constructs FVIII transport was studied in living cells. Comparative immunofluorescence staining, FVIII measurements and western blot analysis demonstrated that the functionality of FVIII was not influenced by the C-terminal fusion to GFP. Confocal live-cell imaging of FVIII-GFP transfected primary cells and cell lines demonstrated that FVIII is mainly distributed in the ER, and moves with a mobility characteristic to lumenale ER proteins. Temperature block experiments of FVIII-GFP transfected cells showed an extended period of time necessary for the accumulation of FVIII in ER exit sites or in the Golgi apparatus and a low frequency of ER-Golgi movements as compared to other secretory GFP tagged proteins. Early secretory transport of FVIII was observed in vesicular tubular cluster at a rate of microtubule dependent transport. The results suggest that inefficient FVIII secretion is due to ER retention. Using siRNA silencing the influence of down regulation of several proteins involved in the intracellular transport on the secretion of FVIII was analyzed. Silencing of several ER cargo receptors (p24, p26, MCFD2) or clathrin adaptin proteins did not lead to a change in FVIII secretion. Only down regulation of the coatomer proteins of the COPI and COPII complex led to a significant reduction in FVIII secretion (78% and 32% reduction, respectively) demonstrating COP dependent early secretory transport of FVIII. (2) As an alternative to the inefficient FVIII expression system in recombinant hamster cell lines, primary chord blood derived endothelial cells offer the advantage of high efficient FVIII secretion and endogenous VWF expression. For the recombinant production of FVIII, however, a steadily growing well characterized cell line would be required. Therefore endothelial cells were transduced with the active subunit of human telomerase (hTERT). Despite successful transduction and long-term expression of hTERT, as measured by GFP expression and Telomerase activity assay (TRAP), the cells stopped dividing after the normal doubling span was reached. Another immortalization gene might be required for successful generation of an endothelial FVIII producer cell line. (3) The use of hematopoietic stem cells for gene therapy approaches for the expression of human FVIII is currently limited due to low efficiency of expression vectors. Therefore several combinations of different transcriptional and post-transcriptional elements in FVIII expression vectors were analysed. A 5' untranslated region (5'UTR) of the haematopoetic expressed FXIIIA gene was identified to be able to significantly increase FVIII expression on the mRNA and protein level in different cell lines and primary cells. The effect was strongest in primary monocytes in which FVIII expression was 6 times higher as compared to the original vector without 5'UTR. Liver cells are also attractive target cells for gene therapy approaches for hemophilia A, as they represent the primary physiological site of FVIII synthesis. For gene therapy vectors ubiquitously expressed viral promoters are often used due to high expression in transduced cells. Use of viral promoters however has several disadvantages such as ectopic expression and increased immune responses and genotoxic effects due to strong interaction with neighbouring promoters in the genome. Therefore, various physiological liver specific promoters were tested as internal promoter in a third generation lentiviral vector for FVIII expression in liver cells. A relatively high expression of 0.5 IU FVIII / ml / 106 cells was obtained using the minimal FVIII promoter which has not been tested before. The FVIII-promoter therefore seems to be suitable for liver targeted expression and to minimize the potential risk of frequently used ubiquitous viral promoters.
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Metadaten
Author:Stefan Heinz
URN:urn:nbn:de:hebis:30-52980
Referee:Rolf Marschalek
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2008/03/14
Year of first Publication:2007
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2008/02/19
Release Date:2008/03/14
Tag:Endothelprogenitorzellen; lentiviraler Vektor
coagulation factor VIII ; gene therapy ; immortalization; intracellular transport ; promoter
SWD-Keyword:Gentherapie ; Gerinnungsfaktor VIII ; Grün fluoreszierendes Protein ; Immortalisierung ; Intrazellulärer Transport ; Promotor <Genetik> ; Telomerase
HeBIS PPN:195727401
Institutes:Pharmazie
Medizin
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

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