Open Access

Gülmisal Güder

• NO ist ein gasförmiges Molekül, das durch drei verschiedene NO-Synthasen hergestellt werden kann. Die Signalkaskaden von NO sind multipel und sehr stark von der jeweiligen Konzentration abhängig. In niedrigen Dosen ist NO an der Regulation physiologischer Prozesse beteiligt, wohingegen hohe NO-Spiegel, wie sie von der induzierbaren NO Synthase (iNOS) im Verlauf von entzündlichen Erkrankungen produziert werden, zytotoxische Effekte wie Apoptose und Nekrose bedingen können. Der Wachstumsfaktor PDGF kann durch Inhibition der iNOS Expression, dieser hohen NO Produktion entgegen wirken. Ob NO im Gegenzug auch eine Wirkung auf das PDGF-System aufweist, sollte mit dieser Arbeit geklärt werden. Da die Aktivität von PDGF letztendlich von der Rezeptormenge abhängt, wurde die expressionsmodulatorische Wirkung von NO auf der PDGF-Rezeptorebene untersucht. Im ersten Teil der Arbeit wurden MZ mit dem NO-Donator DETA-NO stimuliert. Mittels PCR-Analyse konnte gezeigt werden, dass NO die PDGFR-α-mRNA Expression zeit- und dosisabhängig induziert. Die Expression von PDGFR-β wird hingegen nicht wesentlich beeinflusst. Western-Blot-Analysen (WB) bestätigten die Regulierbarkeit des PDGFR-α auch auf Translationsebene. Als nächstes sollte geprüft werden, ob die durch exogene Applikation eines NO-Donatoren hervorgerufene Induktion des PDGFR-α auch durch eine endogene NO-Produktion imitiert werden kann. Hierzu wurden MZ mit dem Zytokin IL-1β inkubiert. IL-1β steigert die iNOS und auch die PDGFR-α-Expression durch Induktion von Transkriptionsfaktoren. Die IL-1β bedingte PDGFR-α-Expression könnte dabei über zwei Mechanismen reguliert werden: Einerseits über die gesteigerte Synthese von NO durch iNOS und andererseits durch direkte Interaktionen der IL-1β-induzierten Transkriptionsfaktoren mit dem PDGFR-α-Promotor. Um die NO bzw. iNOS-vermittelte von der Promotor-vermittelten Wirkung zu unterscheiden, wurden MZ zusätzlich mit dem NOS-Inhibitor L-NMMA inkubiert. L-NMMA war im Stande die durch IL-1β hervorgerufene Erhöhung der PDGFR-α Proteinmenge signifikant auf 60% zu reduzieren, was die Beteiligung der iNOS bzw. von NO an der IL-1β vermittelten Regulation des PDGFR-α impliziert. NO entfaltet seine Wirkung über verschiedene Signalkaskaden. Der klassische Weg verläuft über die Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC). Um die Beteiligung der sGC an der NO-vermittelten Induktion des PDGFR-α zu untersuchen, wurden DETA-NO stimulierte MZ zeitgleich mit ODQ, einem Inhibitor der sGC inkubiert. Die durch NO verursachte Erhöhung der PDGFR-α-Proteinmenge konnte durch die gleichzeitige Zugabe von ODQ komplett gehemmt werden. Die Behandlung von MC mit dem sGC-Aktivator YC-1 imitierte andererseits den NO-Effekt. Beide Versuche zusammengenommen beweisen die Notwendigkeit der sGC-Aktivierung zur NO-vermittelten Induktion des PDGFR-α. Da viele Gene schon auf Transkriptionsebene durch NO beeinflusst werden, wurde der an einen Vektor gebundene PDGFR-α-Promotor vor das Luziferase-Gen kloniert und MZ mit diesem Konstrukt transfiziert. Die transfizierten MZ wurden mit DETA-NO oder 8-BromocAMP stimuliert. cAMP erhöht die Aktivität des PDGFR-α-Promotors und diente somit als Positivkontrolle. Die Promotoraktivität wurde indirekt über das Luziferase-Renilla-System bestimmt. Da NO im Gegensatz zu 8-Bromo-cAMP die Promotoraktivität nicht erhöhte, ist davon auszugehen, dass die NO-abhängige Induktion des PDGFR-α posttranskriptionell erfolgt oder, dass das NO-responsive Element nicht in unserem Konstrukt enthalten war. Im letzten Abschnitt meiner Arbeit wurde die Funktionsfähigkeit des neusynthetisierten PDGFR-α Proteins bestätigt. Hierzu wurde die Phosphorylisierung vom PDGFR-α und von einem weiteren in der PDGF-Signalkaskade angeordneten Enzym, der antiapoptotisch wirksamen Proteinkinase B (PKB) untersucht. Mit DETA-NO vorbehandelte MZ wurden mit PDGF-BB stimuliert und eine Nachweisanalyse mit einem Phospho-spezifischen Antikörper der gegen pTyr720-PDGFR-α (pPDGFR-α) gerichtet ist, durchgeführt. Der Vergleich mit nichtvorbehandelten MZ belegt eindeutig, dass die NO vermittelte Erhöhung der basalen PDGFR-α-Proteinmenge auch zu einer Zunahme an detektierbarem pPDGFR-α führt, die dann wiederum eine Verstärkung der Signaltransduktion zur Folge hat. So konnten in DETANO vorbehandelten MZ, die mit dem α-Rezeptor spezifischen Liganden PDGF-AA stimuliert wurden, eine vergleichsweise erhöhte PKB-Phosphorylierung festgestellt werden. In einer Kooperation mit Dr. L. Schäfer (Universität Münster) konnte ferner gezeigt werden, dass die NO-Abhängigkeit der PDGFR-α Proteinexpression auch im Krankheitsverlauf eines experimentellen Glomerulonephritismodells, zu beobachten ist. Durch WB-Analysen und immunhistologischen Färbungen konnte dargelegt werden, dass die Vorinjektion des iNO-Sspezifischen Inhibitors L-NIL die Produktion von phosphoryliertem und unphosphoryliertem PDGFR-α Protein in Anti-Thy.1.1-behandelten Ratten signifikant hemmt. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass NO über eine Aktivierung der sGC, die Produktion von funktionsfähigem PDGFR-α- Protein in vitro und in vivo steigert. Die pathophysiologische Bedeutung der NO-vermittelten Induktion des PDGFR-α im Krankheitsprozess der GN, wird gegenwärtig in weiteren in vivo Experimenten untersucht.
• NO, a diffusible gas with various physiological and pathological properties, is synthesized by three different forms of nitric oxide synthases (NOS). The effects of NO depend particularly on the actual NO concentration. At low concentrations, NO participates in many physiological processes, whereas high concentrations of NO, produced e.g. by the inducible NOS in the course of inflammatory diseases, initiate apoptosis and necrosis. PDGF, a potent growth factor, is able to counteract NO-production by inhibition of iNOS expression and activity. This work analyses the reciprocal control mechanisms of NO on the PDGF signalling system in rat glomerular mesangial cells (MC). In the first part of my work, the effect of NO on the expression of the PDGF ligands and their receptors was analysed. MC were stimulated with the NO delivering agent DETA-NO. PDGFR mRNA levels were analysed in polymerase chain reaction (PCR) for both receptor subunits. PDGFR-α mRNA expression was time- and dose-dependently induced by NO, whereas mRNA expression of the β-subunit was not significantly affected by DETA-NO. The time- and dose-dependent induction of PDGFR-α mRNA expression by NO could also be confirmed on the protein level by Western blotting. In the second part, the influence of endogenously produced NO on PDGFR-α -protein expression was investigated. MC were stimulated with the cytokine IL-1β, which is a known inducer of iNOS expression in rat MC. Consequently, IL-1β induces PDGFR-α expression. To discriminate between the IL-1β-iNOS-NO pathway and direct IL-1β mediated promoter activation, cells were costimulated with the NOS inhibitor L-NMMA. L-NMMA was not able to completely reverse the IL-1β mediated induction of PDGFR-α protein expression, but it diminished the effect significantly down to 60 %. This result reveals, that IL-1β involves iNOS activation to a certain degree for PDGFR-α induction. There are multiple mechanisms described for NO induced signalling. At subtoxic concentrations the most common pathway is mediated via activation of the soluble guanylyl cyclase (sGC). To examine whether NO uses the sGC pathway to induce PDGFR-α expression, DETA-NO stimulated MC were cotreated with the sGC inhibitor ODQ. ODQ reversed almost completely the NO-mediated effect. Additionally, MC were incubated with the sGC activator YC-1. YC-1 was able to mimic PDGFR-α protein induction concentrationV dependently. Taken together both experiments indicate that the NO induced stimulation of PDGFR-α expression is due to sGC activation. Since NO affects many genes also on a transcriptional level, PDGFR-α promoter was cloned and promoter analysis was performed by the dual-luciferase reporter assay system. MC, transfected with a PDGFRα promoter/luciferase construct were stimulated with DETA-NO or with 8-Bromo-cAMP, a known inducer of PDGFR-α transcription. 8-Bromo-cAMP but not DETA-NO was able to induce PDGFR-α promoter transcription, indicating that the NOdependent stimulation of PDGFR-α expression is mediated posttranscriptionally or, alternatively, that the putative NO responsive element in the PDGFR-α promoter is not included in the cloned genomic DNA fragment. In the last part of my work, the functionality of NO on PDGFR-α expression was tested by analysis of the phosphorylation state of the α-receptor and of the downstream effector molecule protein kinase B (PKB). MC were prestimulated with DETA-NO and thereafter incubated for 15 min with PDGF-BB to activate the receptor. Western blot analysis, performed with anti-pTyr720-PDGFR-α-specific antibody, revealed that the NO-induced elevation of basal PDGFR-α protein level also increases PDGFR-α phosphorylation. Furthermore, an enhanced phosphorylation level of PKB was detected in DETA-NO pretreated cells, which were co-incubated with PDGF-AA, a PDGF isoform that selectively activates the PDGFR-α subunit. In co-operation with Dr. L. Schäfer (University of Münster), the NO-modulated induction of PDGFR-α expression was confirmed in an in vivo model of anti-Thy.1.1 nephritis. Inhibition of iNOS by the iNOS-specific inhibitor L-N6-(1-iminoethyl)lysine (L-NIL) reduced PDGFR- α expression as shown by immunohistochemistry and Western blot analysis. In conclusion, I have demonstrated that exogenously applied or endogenously produced NO induces the expression of PDGFR-α protein and that this increase permits enhanced phosphorylation of downstream effector molecules, which indicates that the actual amount of the receptor dictates the strength of the mitogenic effects of PDGF. NO induces the expression of PDGFR-α in vitro and in vivo. The pathophysiological significance of the NOmediated upregulation of PDGFR-α expression has yet to be clarified in further in vivo experiments.