Open Access

Miriam Pleskova

• The generation of O2- by NADPH oxidaes was mainly attributed to immune cells that kill invading bacteria or cancer cells. But importantly, in the past several years, several homologs of the catalytic subunit gp91phox (Nox2) of the phagocytic NADPH oxidase have been identified in non-immune cells and tissues. Superoxide production derived from NADPH oxidaes has been shown to play a role not only in host defense but also in defined signaling cascades mediating growth and apoptosis. The aim of this work was to study the expression and the regulation of the”new” Nox isoforms in rat renal mesangial cells (MC). In particular the following results were achieved. 1) mRNA’s for both Nox1 and Nox4 were detected by RT-PCR. 2) Nox1 mRNA levels were increased upon exposure to basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet-derived growth factor (PDGF) and fetal calf serum (FCS) in a time- and dose-dependent manner. Exposure of MC to bFGF and FCS increased also basal production of reactive oxygen species (ROS) by MC. By contrast, Nox4 mRNA levels were not significantly affected by bFGF treatment, but were markedly down-regulated by PDGF and FCS. 3) To study the regulation of Nox1 on the protein level, an anti-Nox1 antibody was generated and characterized using affinity chromatography. Up-regulation of Nox1 expression by growth factors was confirmed also on the protein level. 4) Based on the already known cDNA sequence for Nox1, the transcriptional start site was determined by the “gene RACE” technique. 2547 bp of the genomic sequence of the 5´-flanking region of the Nox1 gene were cloned and sequenced using the „Genome-Walking“ method. To study the regulation of Nox1 transcription functional Nox1 promoter/luciferase fusions were be established. MC were transiently transfected with different promoter/luciferase constructs and stimulated with growth factors. By measuring luciferase activity it was determined that growth factors induced the Nox1 transcription and that the Nox1 core promoter is sufficient for the activation. 5) By measurement of superoxide radicals and analysis of Nox1 mRNA expression by quantitative RT-PCR (TaqMan) as well as protein level by Western blotting it could be shown that treatment of MC with NO donors inhibited the expression of Nox1 in a time- and dose-dependent manner. Moreover, using activators and inhibitors of the soluble guanylyl cyclase (sGC) it could be shown, that the activation of sGC mediates the effect of NO on Nox1 expression. However, NO had no inhibitory effect on Nox1 promoter activity. Experiments with the inhibitor of transcription, actinomycin D, suggest that NO-mediated regulation of Nox1 is triggered probably via post-transcriptional mechanisms. Nox4 is regulated on the mRNA levels in a similar manner as Nox1. 6) To analyze the sub-cellular localization of the Nox isoforms, coding sequences for Nox1 and Nox4 were fused together with green fluorescent protein into the pEGFP-N1 demonstrated that both isoforms are localized predominantly in the plasma membrane, but also in the perinuclear region and cytoplasm. However, the localization of Nox1 in the plasma membrane was more pronounced. 7) In addition to Nox1 and Nox4, mRNA of the newly identified NOXA1 that is a homolog of the p67phox subunit of NADPH oxidase was detected in MC by RT-PCR.
• Im Verlauf vieler entzündlicher Erkrankungen werden zelltoxische Mengen Stickoxid (NO) und Superoxid (O2-) gebildet. Verschiedene Enzyme sind in der Lage, diese Radikale zu bilden. Neben den beiden konstitutiv exprimierten Ca++-abhängigen NOSynthasen (eNOS und bNOS), welche wichtige Funktionen bei der Gefäßrelaxation, bzw. der Langzeitpotenzierung des Hippocampus erfüllen, ist die induzierbare Form (iNOS), welche durch pro-entzündliche Zytokine auf der Genexpressionsebene induziert wird, wohl hauptsächlich für das während der Entzündungsreaktion gebildete NO verantwortlich. Gleich mehrere Enzymsysteme (z.B. Xanthinoxidase, P450 Cytochromoxidase, NADPH-Oxidase u.v.a) sind in der Lage Superoxid zu synthetisieren. Nach dem Stand der Forschung noch vor einigen Jahren galt die Bildung von Superoxid als Produkt einer unvollständigen Oxidation, welche bei diversen Stoffwechselvorgängen auftreten kann. Eine Ausnahme davon bildet die NADPH-Oxidase, ein Enzymkomplex, der vor allem in aktivierten Leukozyten große Mengen von Superoxid bildet, welche der Abtötung von Erregern dienen. Während man früher dachte, daß NO und Superoxid bei der Entzündungsreaktion durch infiltrierende Blutzellen synthetisiert werden und ausschließlich eine Rolle in der Immunabwehr durch die Erzeugung von nitrosativem und oxidativem Streß spielen, hat man heute gelernt, die Wirkungen beider Radikale differenzierter zu betrachten. Durch die iNOS gebildetes NO kann fein abgestimmte Signalkaskaden einschalten und sehr spezifisch auf die Expression verschiedener Gene wirken. Eine Reihe von NO-regulierten Genen, wie u.a die Mn++-abhängige Superoxiddismutase (MnSOD) und der „plateletderived growth factor receptor a“ (PDGFRa), konnte auch in unserer Arbeitsgruppe identifiziert werden. In ähnlicher Weise werden auch dem Superoxid und seinen Abbauprodukten, den „reactive oxygen species“ (ROS), mittlerweile neben zytotoxischen Wirkungen auch wichtige Funktionen in der Modulation von Signalprozessen zugeschrieben. Nicht zuletzt die Entdeckung „neuer“ katalytischer Untereinheiten der NADPH-Oxidase, welche vor allem in gewebsständigen Zellen vorkommen und deren Aufgabe es ist, Mengen von Superoxid zu bilden, welche für das Abtöten von Erregern nicht ausreichen, wohl aber in der Lage sind spezifische Signalkaskaden die z.B. die Zellproliferation fördern, zu steuern. Besonders wichtig für physiologische und pathophysiologische Prozesse ist das molare Verhältnis von Superoxid und NO. Beide Moleküle neutralisieren sich gegenseitig durch die Bildung von Peroxynitrit (ONOO-). Dies hat zur Folge daß – je nach gebildeter Menge – jeweils der Überschuß eines der Radikale alleine die Wirkungen bestimmt. Mesangiumzellen sind den glatten Muskelzellen ähnliche Perizyten, welche eine wichtige Rolle in der glomerulären Entzündungsreaktion spielen. Diese Zellen synthetisieren pro-inflammatorische Zytokine sowie Superoxid und NO und potenzieren so die Entzündungsantwort bei entzündlichen Prozessen im Glomerulum. Mesangiumzellen stellen somit ein ideales Modell zur Untersuchung der Wirkungen von Zytokinen, ROS und NO dar. Unsere Arbeitsgruppe konnte bereits zeigen, daß ROS die Zytokin-induzierte Expression der iNOS beträchtlich steigern. Idee und Ziel dieser Arbeit war, einerseits zu prüfen, welche der neu beschriebenen Isoformen der NADPH-Oxidase in Mesangiumzellen exprimert werden und wie diese Isoformen durch Wachstumsfaktoren und NO in ihrer Expression reguliert werden. Insbesondere die genaue Kenntnis der Synthese beider Radikale sowie die gegenseitige Beeinflussung der Expression der Enzyme, welche diese Moleküle synthetisieren könnte die Tür zu neuen Strategien in der Behandlung entzündlicher Erkrankungen öffnen. Um die Regulation verschiedener NADPH-Oxidase Untereinheiten in Mesangiumzellen untersuchen zu können, wurden zunächst Primersequenzen ausgewählt welche nach einer RT-PCR Reaktion spezifische Amplifikate für die kürzlich charakterisierten katalytischen NADPH-Oxidase Untereinheiten Nox1 und Nox4 erzeugten. Um die Daten bezüglich der Regulation der Nox1 mRNA besser quantifizieren zu können wurde zudem eine quantitative RT-PCR Methode (TaqMan) etabliert. Anschließend wurde die Regulation der mRNA-Spiegel von Nox1 nach Stimulation mit den Wachstumsfaktoren „basic fibroblast growth factor“ (bFGF), „platelet-derived growth factor“ (PDGF) und fötalem Kalbsserum (FCS) untersucht. Es zeigte sich, daß alle Stimuli die mRNA Expression von Nox1 zeit- und dosisabhängig steigerten. Die Behandlung mit Wachstumsfaktoren führte auch zu einer erhöhten Bildung von Superoxid im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen. Im Gegensatz dazu waren die Nox4 mRNA-Spiegel von der bFGF Behandlung nicht beeinflußt, wurden aber eindeutig nach Behandlung mit PDGF und FCS herunterreguliert. Um die Regulation von Nox1 auch auf Proteinebene untersuchen zu können wurde ein polyklonaler Antikörper gegen eine von der Nox1 cDNA Nukleotidfolge abgeleiteten Peptidsequenz hergestellt. Mittels affinitätschromatografischer Methoden sowie Kompetitierungsexperimenten mit dem Peptid, gegen welches die Antikörper im Kaninchen hergestellt wurden, konnte eindeutig eine für Nox1 immunoreaktive Bande charakterisiert werden. Eine Steigerung der Nox1-Expression durch Wachstumsfaktoren konnte mit Hilfe dieses Antikörpers auch auf der Proteinebene bestätigt werden. Diese Ergebnisse zeigen, daß neben dem in der Glomerulonephritis wichtigen wachstumsstimulierenden Entzündungsfaktor PDGF auch bFGF, ein Peptid welchem ein hohes Potential in der Bildung von Superoxid im Verlauf der Glomerulonephritis zugeschrieben wird, die Expression und Funktion von Nox1 steigert. In einem weiteren Schritt sollten die Mechanismen der Wachstumsfaktor-abhängigen Expression von Nox1 genauer untersucht werden. Bevor die hierfür erforderlichen genomischen DNA-Bereiche, welche die 5´-flankierende Region des Nox1 Gens repräsentieren kloniert werden konnten, mußte zunächst der Transkriptionsstart des Nox1 Gens möglichst genau bestimmt werden. Dieses Vorgehen ist nötig, da die geplanten Promotor-Reportergenfusionen einerseits die den Transkriptionsstart umgebenden Sequenzen enthalten müssen und andererseits ausgeschlossen werden muß, daß sich ein Intron zwischen der publizierten cDNA-Sequenz und dem Transkriptionsstart befindet. Ausgehend von der bereits bekannten cDNA-Sequenz für Nox1 wurde mittels der „Rapid Amplification of cDNA Ends“ (RACE) Technik der Transkriptionsstart bestimmt. Diese Technik hat gegenüber der sonst üblicherweise zu diesem Zweck angewendeten Methode der „Primer Extension“ den Vorteil, daß aus den dabei erhaltenen Klonen die cDNA-Sequenz ermittelt werden kann. Die Sequenzierung der mit der RACE-Technik erhaltenen Klone ergab schließlich, daß sich die mRNA für Nox1 im 5´-Bereich um 26 bp weiter ausdehnt als es in der Literatur bisher beschrieben war. Für die Amplifizierung von Nox1 Promotor-haltigen DNA Fragmenten wurde die sog. „Genome-Walking“ Methode eingesetzt. Ähnlich wie bei der RACE Technik werden zunächst kurze Nukleotidsequenzen (Adaptoren) an genomische endonukleolytisch gespaltene Ratten-DNA ligiert. Genspezifische Klone können dann mittels „nested“ PCR durch Verwendung genspezifischer Oligonukleotide sowie Oligonukleotiden, welche homolog zu den Adaptoren sind amplifiziert werden. Mit dieser Methode wurden insgesamt 2547 bp der Nox1 5´-flankierenden genomischen Sequenz kloniert und sequenziert. Durch die genaue Kenntnis des Transkriptionsstarts konnten nun funktionelle Nox1-Promotor/Luziferase Fusionen im Vektor pGL3 für die Untersuchung der Regulation der Nox1 Transkription hergestellt werden. Nach transienter Transfektion verschieden langer Promoter/Luziferase-Fusionen in MZ und Messung der Luziferase-Aktivität wurde festgestellt, daß Wachstumsfaktoren die Transkription des Nox1-Genes stimulieren und daß ein kleiner Bereich von 187 bp des Nox1 „Core-Promotors“ für die Aktivierung durch Wachstumsfaktoren ausreicht. Die Wirkung der Wachstumsfaktoren auf die Nox1 Expression beruht also auf einer Erhöhung der transkriptionellen Aktivität des Genpromotors. Die Bereitstellung der oben beschriebenen Hilfsmittel ermöglichte nun auch die Untersuchung der Wirkungen von NO auf die Expression von Nox1. Durch Messung der Bildung von Sauerstoffradikalen und Analyse der Nox1 mRNA-Expression durch quantitatives RT-PCR sowie der Protein-Spiegel mittels Western-Blot konnte gezeigt werden, daß die Inkubation von Mesangiumzellen mit NO-Donatoren die Expression von Nox1 zeit- und dosisabhängig hemmt. Durch den Einsatz von YC-1, einem synthetischen Aktivator der löslichen Guanylyl-Zyklase (sGC) sowie 8-Bromo-PET-cGMP, einem membranpermeablen Derivat des zyklischen GMP konnte zudem gezeigt werden, daß der NO-Effekt auf eine Aktivierung der sGC zurückzuführen ist. Diese Ergebnisse wurden gestützt durch die Tatsache, daß ODQ und NS-2028, zwei Inhibitoren der sGC, die NOvermittelte Hemmung der Nox1 Expression aufheben konnten. Wie nach Transfektion von Mesangiumzellen mit verschiedenen Nox1-Promotor/Luziferase Fusionen gezeigt, vermittelt NO jedoch keine hemmende Wirkung auf die basale Nox1 Promotoraktivität. Durch Versuche mit dem Transkriptionsinhibitor Actinomycin D konnten Hinweise gefunden werden, daß das Phänomen der NO-vermittelten Regulation von Nox1 wahrscheinlich auf post-transkriptionelle Mechanismen zurückzuführen ist. In ähnlicher Weise wie Nox1 ist auch Nox4 auf der mRNA-Ebene durch NO reguliert. Auch hier verläuft die NO-vermittelte Hemmung der Expression über den cGMP Signaltransduktionsweg. Ebenso scheinen post-transkriptionelle Mechanismen für die NO-vermittelte Regulation verantwortlich zu sein. Die Tatsache, daß die mRNA beider Nox-Subtypen zahlreiche AUUUA Sequenzen, welche potentielle Bindungsstellen für RNA-stabilisierende oder -destabilisierende Proteine repräsentieren im 3´-Bereich tragen, untermauert zusätzlich diese Hypothese. Untersuchungen zu Regulation des Nox4-Proteins konnten jedoch nicht durch geführt werden, da keine geeigneten Antikörper für solche Untersuchungen zur Verfügung standen. Um die subzelluläre Lokalisation der Nox Isoformen zu charakterisieren wurden Fusionen des kodierenden Bereichs von Nox1 und Nox4 mit dem „green fluorescent protein“ im Vektor pEGFP-N1 hergestellt. Durch Transfektionen von humanen embryonalen Nierenzellen (HEK 293) konnte gezeigt werden, daß beide Isoformen vorwiegend an der Plasmamembran, aber auch perinukleär und im Zytosol lokalisiert sind, wobei die Lokalisierung an der Membran für Nox1 ausgeprägter erscheint. Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß NO durch die Herunterregulation der für die Synthese von ROS verantwortlichen Enzymsysteme seine eigene Bioverfügbarkeit im Entzündungsprozeß unterstützt. Die oben geschilderten Beobachtungen stellen aber nur einen Teil der Prozesse dar, welche letztlich zu einer von NO dominierten Chemie im entzündeten Gewebe führen. In diesem Zusammenhang ist erwähnenswert, daß NO direkt die Enzymaktivität der NADPH-Oxidase hemmt und daß NO auch seine eigene Synthesemaschinerie durch Verstärkung der Zytokin-induzierten iNOS Expression beeinflußt. Andererseits sorgen auch Sauerstoffradikale für eine Verstärkung der iNOS Expression und limitieren durch die Neutralisierung über das neu synthetisierte NO ihre eigene Verfügbarkeit im entzündeten Gewebe. Eine Hochregulation der zytosolischen und mitochondriellen Superoxiddismutasen durch NO trägt zusätzlich zu einer Verminderung der Superoxidspiegel bei. Diese Fakten lassen die Hypothese zu, daß beim initialen Entzündungsprozeß zunächst über eine rasche Aktivierung der NADPH-Oxidasen große Mengen an Sauerstoffradikalen gebildet werden. Aufgrund der relativ langsam verlaufenden Induktion der iNOS dominieren deshalb zunächst Sauerstoffradikale am Entzündungsort. In einer Übergangsphase entstehen äquimolare Mengen von ROS und NO welche sich gegenseitig zu neutralisieren vermögen, welche aber auch gemeinsam in der Lage sind, Proteine zu nitrieren oder nitrosieren. Dies kann zu einer für die Zelle schädlichen Änderung der Aktivität der betroffenen Enzyme führen. Im weiteren Verlauf verschiebt sich aufgrund der bereits oben erwähnten Mechanismen die Balance in die von NO dominierte Richtung. Eine Inhibition der NO-Synthese als Therapie entzündlicher Erkrankungen verhindert zwar die Bildung von zytotoxischem NO, verschiebt aber auch die Mikroumgebung der Zelle in eine von schädlichen Sauerstoffradikalen dominierte Chemie. Tierexperimentelle Studien für verschiedene Modelle der Entzündung zeigen, daß eine Inhibition der NO-Synthese in der akuten Phase den Verlauf der Erkrankung zwar mildern kann. In chronischen Entzündungsmodellen scheint dagegen ein Mangel an NO eher schädliche Wirkungen zu haben. Einer der Gründe hierfür könnte in der mangelnden Kontrolle der Expression wichtiger Untereinheiten der NADPH-Oxidase liegen. Weitere Studien sind nötig, um die diesem Phänomen zugrundeliegenden molekularen Mechanismen und deren Relevanz für Entzündungsvorgänge vollständig aufzudecken.