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Borna Relja

• Shock resulting from life-threatening blood-loss (hemorrhagic shock) represents the most frequent injury pattern after a traumatic insult. Hemorrhagic shock induces inflammatory changes, characterized by highly complex pathophysiological pathways often resulting in death. In this study, we establish an experimental in vivo model of H/R in rats and study the mechanisms which determine the hepatic injury after H/R. Furthermore, we show that hemorrhagic shock with following resuscitation is accompanied with release of systemic and local pro-inflammatory mediators, increased infiltration of hepatic neutrophils in the liver, increased oxidative and nitrosative stress, enhanced cell death of both types, apoptosis and necrosis, conspicuous cytoskeletal rearrangements, loss of hepatic integrity and finally high general mortality rates, up to 80%. In addition, the effects of two potential therapeutic interventions to prevent the H/R induced liver injury are explored in a model of H/R in rats. First, the role of JNK and its inhibition by D-JNKI-1 in preservation of hepatic integrity following H/R was analyzed. Second, we investigated the potential of simvastatin to prevent the disturbed inflammatory response and hepatic injury after H/R. The effects of both therapeutic interventions were studied by looking at several inflammatory parameters, markers of oxidative and nitrosative stress, cytoskeleton integrity, microcirculatory parameters, underlying signaling cascades, liver damage and mortality. Highly specific blockade of JNK with the potent, inhibitory peptide D-JNKI-1 revealed the crucial role of the JNK signaling pathway in the H/R induced pathophysiology and strong protective effects of DJNKI- 1 in H/R induced liver injury, when the peptide was applied before and even after hemorrhagic shock. The other therapeutic intervention tested in this study was the use of simvastatin which also revealed protective effects after H/R and even a remarkable improvement in survival after H/R. We show that H/R induced release of pro-inflammatory cytokines, hepatic PMNL infiltration, increased oxidative and nitrosative stress, apoptosis and necrosis can be diminished by treatment with D-JNKI-1 but also with simvastatin in vivo. Furthermore, simvastatin reduces H/R induced cytoskelatal rearrangements, loss of liver integrity and the mortality rate after H/R. The key pathway which underlies these beneficial effects of simvastatin is the Rho kinase pathway. Identification of both mechanisms as well as the effectiveness of both substances provide new insights in the close interaction between hypoxia and the immune system and present a promising basis for the anti-inflammatory, hepatoprotective treatment after H/R.
• Das häufigste Verletzungsmuster nach einem Trauma stellt der hämorrhagische Schock (HS), resultierend aus massivem Blutverlust, dar. Der akute Volumenmangel sowie der zusätzliche Mangel an Sauerstoffträgern setzt zahlreiche pathophysiologische Vorgänge auf der Ebene der Makrozirkulation, der Mikrozirkulation und des Stoffwechsels in Gang. Während dieses ischämischen Geschehens stellt der Organismus aufgrund des Sauerstoffmangels auf den anaeroben Stoffwechsel um, und es kommt zu einer veränderten metabolischen Situation. Durch die reduzierte Energiesynthese von Adenosintriphosphat ensteht ein Überschuss an Adenosinmonophosphat, das unter anaeroben Bedingungen verstoffwechselt wird. Hierbei entstehen freie Sauerstoff- und Stickstoffradikale, welche ursächlich für den späteren Reperfusionsschaden betrachtet werden. Die primäre Schädigung einzelner Organe findet in der hypoxischen Phase statt, doch durch die Wiederherstellung der Durchblutung und somit der aeroben Stoffwechsellage, bedingen die in den Endothelzellen zuvor angefallenen Superoxidanionen eine vermehrte Freisetzung der freien Radikale. Die begrenzte Kapazität des Organismus die entstandenen freien Radikale zu reduzieren, führt dazu, dass hochreaktive Hydroxylradikale Membranlipidperoxidationen induzieren. Zudem reagiert das Peroxynitrit, das unter hypoxischen Bedingungen entsteht, mit Tyrosinresten der intrazellulären Proteine und schädigt diese. Bei diesen Reaktionen entstehen 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE), eines der reaktivsten Autooxidationsprodukte, und 3-Nitrotyrosin (3-NT); -Verbindungen, die mit apoptotischen Vorgängen assoziiert sind, welche zu starken Gefäß- und Gewebeschäden führen. Der Verlust der zellulären Integrität führt zur erhöhten kapillären Permeabilität während der Reperfusionsphase, wodurch die Migration der Leukozyten ins umliegende Gewebe und die Bildung damit einhergehender, entzündlicher Infiltrate verstärkt wird. Die Leukozyten setzen wiederum freie Radikale frei und induzieren ebenfalls eine Schädigung intrazellulärer Proteine sowie der DNA. Parallel zu diesen Vorgängen gelangen im Rahmen eines hämorrhagischen Schockgeschehens mit nachfolgender Reperfusion (Hämorrhagie/Reperfusion, H/R) und den dadurch ischämie-bedingten Zellschäden, Bakterienabfallstoffe, Bakterien sowie Toxine des Darms in den portalen Kreislauf. Folglich werden in der Leber, dem zentralen Organ der „Entgiftungsvorgänge“ im Körper, Kupfferzellen stimuliert, welche eine hepatische Inflammationsreaktion in Gang setzen. Diese ist gekennzeichnet durch eine vermehrte Freisetzung pro-inflammatorischer Zytokine, z. B. des Interleukins-6 (IL-6), und der damit einhergehenden, gesteigerten Migration und Adhäsion aktivierter Leuko- und Monozyten ins umliegende Gewebe. Eine dauerhafte Adhäsion der Leukozyten in den Sinusoiden der Leber vermindert die hepatische Mikrozirkulation, welche wiederum zum Verlust der hepatozellulären Integrität und somit der Funktionsfähigkeit der Organs führt. Die Inflammationsreaktion, welche durch H/R induziert wird, ist entsprechend durch komplexe, mehrstufige pathophysiologische Vorgänge charakterisiert, welche oftmals in einem Organversagen und tödlich enden. Das Ziel dieser Arbeit – neben der Charakterisierung dieser Vorgänge nach H/R – ist die Findung potenzieller Therapiemöglichkeiten für die schwerwiegenden Folgen der H/R. Neben der Stillung der Blutung ist die Organprotektion ein äußerst wichtiges Ziel der Therapie. Hierbei stellen die in pathophysiologische Vorgänge involvierten Signalkaskaden einen „Angriffspunkt“ dar, und die anti-inflammatorisch wirkenden Substanzen, welche den oben beschriebenen Vorgängen nach H/R entgegen wirken können, bieten eine weitere Therapieoption dar. In der vorliegenden Arbeit wurde ein experimentelles in vivo H/R-Modell in Ratten etabliert, sowie die der H/R zugrunde liegenden Mechanismen der Leberschädigung untersucht. Nach 12stündigem Futterentzug wurden die Ratten durch kontinuierliche Blutentnahme bis zu einem Blutdruck von 30-35 mm Hg in den hämorrhagischen Schock (HS) versetzt. Anschließend an den 60minütigen HS, erfolgte die 30minütige Reperfusion mit Eigenblut und Ringer Laktat-Lösung. Zwei Stunden nach dem Wundverschluss wurden die Tiere durch Entbluten getötet und die Leber entnommen. Kontrolltiere wurden operiert aber der HS wurde nicht induziert. Für die Untersuchungen der Mortalität wurden weitere Tiere über einen Zeitraum von 72 Stunden nach H/R beobachtet. Zur Beurteilung des Leberschadens beziehungsweise der allgemeinen Zellschäden wurden die Serumspiegel der Alanin-Aminotransferase (ALT) sowie der Laktat-Dehydrogenase (LDH) gemessen. Hepatische Nekroseareale sowie Apoptose wurden immunhistochemisch mittels der Hämatoxylin-Eosin-Färbung beziehungsweise der immunhistologischen TUNEL/M30-Färbung dargestellt. Die immunhistologische TUNEL-Färbung dient zum Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen, welche sowohl während der Nekrose als auch während der Apoptose auftreten. Zur Differenzierung der beiden Zelltodtypen wurde immunhistologisch M30 angefärbt, ein Zytokeratin-18 Spaltprodukt, welches durch die Aktivform der Caspase-3 ensteht, und somit ausschließlich während der Apoptose vorhanden ist. Der oxidative Stress wurde immunhistologisch mittels des anti-4-HNE-Antikörpers; der nitrosative Stress mittels des anti-3-NT-Antikörpers, dargestellt. Als Inflammationsmarker wurde mittels eines enzymgekoppelten Immunadsorptionstests (ELISA) sowohl im Serum als auch in der Leber IL-6 gemessen. Das Vollblut wurde mit Lipopolysaccharid (LPS) stimuliert, um die TNF-alpha Freisetzung der zirkulierenden Monozyten im Überstand mittels ELISA zu evaluieren und somit Rückschlusse auf die Immunkompetenz der Monozyten nach H/R zu ziehen. Zudem wurde die lokale Inflammation mittels der histologischen Chloroacetat Esterase-Färbung, welche polymorphonukleäre neutrophilen Leukozyten im Leberparenchym darstellt, analysiert. Die Aktinzytoskelettveränderungen wurden mittels der Phalloidin-Alexa Fluor 488-färbung dargestellt. Western blot-Analysen sollten die in Hämorrhagie/Reperfusionsgeschehen involvierten Signalkaskaden aufdecken. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass H/R mit der Freisetzung systemischer und lokaler, pro-inflammatorischer Mediatoren, Zytokine (IL-6 und TNF-alpha), der gesteigerten Aktivität der zirkulierenden Leukozyten und der daraus folgenden Adhärenz in den Sinusoiden der Leber, und der Ausbildung entzündlicher Infiltrate einhergehen. Zudem induziert H/R sowohl den oxidativen als auch den nitrosativen Stress, deutlich erhöhte Apoptose- sowie Nekroseraten und Zytoskelettmodifikationen in der Leber. Diese Veränderungen führen zur Zerstörung der Parenchymstruktur, zum Verlust der hepatischen Integrität bis hin zu lebensbedrohlichen Auswirkungen auf den Gesamtorganismus mit Mortalitätsraten von bis zu 80% in unserem H/R-Modell. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirksamkeit von zwei Substanzen, D-JNKI-1 und Simvastatin, auf die leberschädigenden Folgen der H/R in vivo untersucht. D-JNKI-1 inhibiert hochspezifisch die c-Jun N-terminale Kinase JNK, während Simvastatin, ein gut beschriebener HMG-CoA Reduktasehemmer und Lipidsenker, über zahlreiche sogenannte „pleiotrope“ Effekte vefügt, welche auch auf sein anti-inflammatorisches Potential schließen lassen. D-JNKI-1 wurde im ersten Teil der Studie in einer Konzentration von 11 mg/kg Körpergewicht vor der Induktion der H/R intraperitoneal (i. p.) appliziert, während es im zweiten Teil der Studie unmittelbar nach Vollendung des HS appliziert wurde. In einem dritten Teil der Studie wurde Simvastatin einmal täglich 6 Tage vor H/R in einer Konzentration von 5 mg/kg Körpergewicht i. p. appliziert. JNK gehört zur Familie der mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK), welche hauptsächlich unter „Stress-“ sowie hypoxischen Bedingungen aktiviert werden. D-JNKI-1 ist ein kürzlich entwickeltes, spezifisches, zellgängiges, proteaseresistentes Protein, das aktiv in die Zelle transportiert wird. Der Mechanismus der Hemmung der JNK durch D-JNKI-1 beruht auf der kovalenten Bindung des Peptids an die Bindungsdomäne, an welche auch das Hauptsubstrat der JNK, c-JUN bindet. C-JUN bildet in inaktiver Form einen Proteinkomplex mit dem Transkriptionsfaktor (TF) „activator protein“-1 (AP-1), dessen Aktivierung unter anderem zur Expression inflammatorischer Zytokine führt. In unserer Studie deckte die selektive Blockierung des JNK Signalweges mit dem Inhibitorpeptid D-JNKI-1 die wesentliche Rolle des JNK Signalweges in der H/R-induzierten Pathophysiologie. Die durch die H/R induzierte c-JUN Phosphorylierung wurde mit D-JNKI-1 gehemmt, und ging mit protektiven Effekten des D-JNKI-1 auf H/R-induzierte Leberschädigungen einher. Die inhibitorische Wirksamkeit und die protektive Wirkung des Peptids blieben sowohl bei einer „Therapierung“ vor als aus nach dem HS erhalten. Zudem zeigt die durch D-JNKI-1 reduzierte TNF-alpha Expression der Monozyten nach einer LPS-Stimulation, dass der TF AP-1 bei der Expression der proinflammatorischen Zytokine der Monozyten eine Rolle spielt. Simvastatinbehandlung vor HS wies ebenfalls protektive Effekte nach H/R auf. Die H/R bedingte Freisetzung systemischer sowie lokaler pro-inflammatorischer Zytokine, hepatische Infiltration mit Neutrophilen, oxidativer und nitrosativer Stress, apoptotische und nekrotische Vorgänge, konnten in vivo sowohl durch eine Behandlung mit D-JNKI-1 als auch mit Simvastatin stark reduziert werden. Zudem verminderte Simvastatin die H/R bedingte Zytoskelettveränderungen, den Verlust der Leberintegrität sowie die Mortalitätsraten. Da es nach H/R zu Veränderungen des Zytoskeletts beziehungsweise des F-Aktins kommt, folgen dem Verlust des intakten Zytoskeletts vermehrt apoptotische und nekrotische Zelluntergänge. Eine eventuelle Stabilisierung des Zytoskeletts durch Simvastatin könnte zu einer Stabilisierung der mRNA der endothelialen Stickstoffsynthase (eNOS) führen, welche zu einer erhöhten eNOS- Proteinexpression führt. Es ist bekannt, dass eine erhöhte Expression der eNOS, und somit die erhöhte Freisetzung des Stickstoffmonoxids, zur Relaxation der glatten Muskelzellen der hepatischen Gefäße führt, welche wiederum zur Aufrechterhaltung der hepatischen Mikrozirkulation führt, und so den ischämie-bedingten Schäden entegegen wirkt. Zusätzlich zur eNOS erhöht Simvastatin die Proteinexpression der Heme-Oxygenase-1, welche bei der Erhaltung der Mikrozirkulation unter Stressbedingungen eine Rolle spielt. Der diesen Vorgängen zugrunde liegende Mechanismus verläuft über den Rho Kinase Signalweg, der neben dem JNK Signalweg maßgebend für die Inflammationsveränderungen und Organschäden nach H/R scheint. Die Aktivierung des Rho Kinase Signalweges nach H/R sowie dessen Inhibierung nach Simvastatingabe wurde über die Aktivierung des Rho-Kinase Substrats „myosin phosphatase targeting subunit“ (Thr696-MYPT) nachgewiesen. Der Schlüssel zu einer geringeren Mortalität nach H/R liegt vermutlich in der antiinflammatorischen Wirkung des Simvastatins sowie dem Erhalt der Organintegrität. Die hohe Wirksamkeit beider Substanzen sowie die Identifizierung beider Mechanismen verschaffen neue Einblicke in die konstante Interaktion zwischen einem hypoxischen Geschehen und dem Immunsystem, und stellen eine vielversprechende Basis für eine anti-inflammatorische Therapiemöglichkeit nach H/R dar. Während sich D-JNKI-1 als hochwirksam auch als eine post-Schock-Therapie erwiesen hat, sollte in weiteren Studien die Wirksamkeit des Simvastatins – appliziert zu einem frühen Zeitpunkt nach H/R, überprüft werden, um offene Fragen nach dem klinischen Nutzen zu beantworten.