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Sa Lan Nguyen

• Die Gamma-Glutamyl-Carboxylase spielt eine Schlüsselrolle im menschlichen Organismus, da sie für die posttranslationale Modifikation sämtlicher Vitamin-K-abhängiger Proteine verantwortlich ist. Ein hereditärer Mangel aller Vitamin-K-abhängigen Faktoren aufgrund eines Defekts in der Gamma-Glutamyl-Carboxylase (VKCFD1) ist sehr selten und geht mit einer gesteigerten Blutungsneigung einher. Aktuelle Arbeiten zeigen eine weitere Manifestation von Mutationen im Gamma-Glutamyl-Carboxylase-Gen, die ein dermatologisches Krankheitsbild, ähnlich der Pseudoxanthoma elasticum, darstellt. In diesen Fällen zeigen die Patienten sowohl dermatologische Effloreszenzen im Sinne der PXE als auch eine Verminderung der Vitamin-K-abhängigen Faktoren. Es wird vermutet, dass die PXE-ähnlichen Hautveränderungen auf eine Funktionsstörung des Matrix-Gla-Proteins zurückzuführen sein könnten. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mutationsdiagnostik bei vier Patienten mit kongenitalem Mangel aller Vitamin-K-abhängigen Gerinnungsfaktoren durchgeführt. Insgesamt wurden dabei fünf Mutationen nachgewiesen, davon vier Missense-Mutationen und eine Stopp-Mutation. Zwei der Patienten wiesen eine „compound Heterozygotie“ auf. Bei den gefunden Mutationen wurden drei im Rahmen dieser Arbeit erstmals aufgezeigt, die anderen zwei waren in der Literatur bereits beschrieben. Bei einer der Mutationen konnte ein „Founder“-Effekt in Bezug auf einen anderen Patienten aus der Literatur nachgewiesen werden. Sollte zukünftig diese Mutation in Deutschland vorkommen und sich auch auf die „Founder“-Mutation zurückführen lassen, böte sich dieser Mechanismus als eine Erklärung für das gehäufte Vorkommen der VKCFD Typ 1 in Deutschland an. Ein Hinweis auf eine PXE-like Disorder konnte bei keinem der Patienten nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde die genetische Variabilität des Gamma-Glutamyl-Carboxylase-Gens in der Normalbevölkerung untersucht. Für die Untersuchungen wurde zunächst die DNA einer phänotypisch unauffälligen Kontrollgruppe, bestehend aus 200 gesunden Blutspendern, auf Genvariationen im GGCX-Gen analysiert. Nach der Isolierung und der Amplifikation der DNA wurde mit sämtlichen Proben zunächst ein Mutations-Screening mittels dHPLC durchgeführt. Auffällige Abschnitte und solche, bei denen häufige und/oder mehrere Polymorphismen bereits bekannt waren, wurden sequenziert. Auf diese Weise wurden acht Polymorphismen in den codierenden bzw. die Exone flankierenden Genabschnitten nachgewiesen. Davon wurden zwei erstmals beschrieben (c.43+33T>A; c.1288-38T>C). Schließlich sollte mit dieser Arbeit versucht werden zu klären, wie eine möglichst effiziente Diagnostik von Mutationen bzw. Polymorphismen des GGCX-Gens möglich ist. In unseren Untersuchungen wurde sowohl mit der dHPLC (Wave-System) als Screening-Methode gearbeitet als auch Genabschnitte sequenziert. Mittels der dHPLC kann ein hohes Probenaufkommen in kurzer Zeit mit vergleichsweise geringem Aufwand und vergleichsweise geringeren Kosten (ca. 30 € pro Genuntersuchung vs. Komplettsequenzierung ca. 300 €) bewältigt werden. Bei Genabschnitten mit vielen oder häufigen Polymorphismen ist dies ineffektiv, weil es nur das Vorhandensein einer Veränderung, nicht jedoch die Veränderung selbst beschreiben kann. Daher empfiehlt es sich, beide Methoden zu kombinieren, welches sich als die effizienteste und rationalste Methode für die Mutationsdiagnostik darstellt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sind von grundsätzlichem Interesse für die biomedizinische Forschung. Eventuell wird es damit dann möglich sein, Krankheitsentstehungen und ihre Verläufe bei Mutationen der Gamma-Glutamyl-Carboxylase besser zu verstehen und damit eine noch effektivere und nebenwirkungsärmere Therapie einzusetzen.
• The Gamma-glutamyl-carboxylase plays a key role in the human organism, as it is responsible for posttranslational modification of all vitamin-K-dependant proteins. A hereditary deficiency of all vitamin-K-dependant factors based on a defect of the Gamma-glutamyl-carboxylase (VKCFD 1) is rare and corresponds with an increased tendency to bleeding complications. Recent studies show an additional clinical manifestation of the GGCX gene, which seems to be a dermatological disease pattern similar to Pseudoxanthoma Elasticum. In these cases patients show dermatological efflorescences as well as a decrease of all vitamin-K-dependant factors. It is assumed, that the cutaneous changes could be attributed to a disfunction of matrix-gla-protein. In this thesis a mutation diagnosis on four patients with congential deficiency of all vitamin-K-dependent clotting factors have been undertaken. In total, five mutations have been detected – four missense mutations and one stop_mutation. Two of the patients exhibited „compound heterozygosity“. In this study, two of the detected mutations have been documented for the first time; the other three have already been described in literature before. At one of the mutations a „founder effect“ in connection with another patients could be found. If this mutation should occur in Germany again and be traced back to this „founder mutation“, this mechanism would be an explanation for an accumulation of VKCFD Typ 1 in Germany. A sign for PXE-like disorder could not be detected in any of the patients. In addition the genetic variability of the Gamma-glutamyl-carboxylase-gene in the overall population has been researched. For the examinations, DNA of a control group (200 healthy blood donors) without pathological phenotypical findings have been analysed for gene variations on the GGCX-gene. After the isolation and amplification all DNA samples have been analysed with mutations screening by dHPLC. Noticiable parts and those, for which frequent and/or prevalent polymorphisms have been stated before, were sequenced. Eight polymorphisms in the coding and exon-flanking regions have been detected by applying this method, two of them for the first time (c.43+33T>A; c.1288-38T>C). Additionaly, the thesis tried to clarify how efficient diagnostic of mutations and polymorphisms of the GGCX-gene could be undertaken. In our research we applied dHPLC (WAVE-system) as well as gene sequencing. By applying the dHPLC-method a larger batch of samples can be analysed in a short-time span with comparable less effort and, even more important, comparably at lower costs (approximately €30 per gene analysis vs. complete sequencing at € 300). When applied at gene parts with numerous or frequent polymorphisms, the method is ineffective, as only the existence of alteration per se is marked, but not the alteration type. Looking at the quality of the results, it is recommendable to combine the two methods, which results in the most efficient and most rational method for mutation diagnosis. The results of this thesis bear fundamental interest for the biomedical sciences & research. There might be options, for better understanding pathogeneses and their characteristics in Gamma-glutamyl-carboxylase-gene defects and therefore develop a therapy which will be more effective and with few side effects.