Vergleichende Analyse aktivierter Proviren der humanen endogenen Retrovirus-Familie HERV-K/HML 2 und Erarbeitung eines Modells zur Steuerung ihrer Expression in Melanom- und Keimzelltumorlinien

Analysis of reaktivated proviruses of the human endogenous retrovirus familie HERV-K/HML2 and creation of a model for transcriptional control in melanoma and teratocarcinoma cell lines

Humane endogene Retroviren (HERVs) sind Relikte von Infektionen der Keimzellen von Primatenvorläufern mit exogenen Retroviren vor 40 Millionen Jahren. Die meisten HERV Elemente sind defekt durch die Akkumulation von Muta
Humane endogene Retroviren (HERVs) sind Relikte von Infektionen der Keimzellen von Primatenvorläufern mit exogenen Retroviren vor 40 Millionen Jahren. Die meisten HERV Elemente sind defekt durch die Akkumulation von Mutationen, Deletionen und Rearrangements. Lediglich einige Proviren der HERV-K/HML-2 Familie enthalte noch offenen Leserahmen für alle retroviralen Proteine. Die Expression repetitiver endogener Elemente wird in somatischen Zellen unterdrückt. Transkription und Translation von HERV-K Genprodukten tritt in Keimzelltumoren, Melanomen und Eierstockkrebs auf. In der vorliegenden Arbeit wurde die HERV-K exprimierende Melanomlinie UKRV Mel 2-C9 etabliert und charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die HERV-K Expressionen durch die dominante Aktivität des Provirus 108 bedingt ist. Die Expression und korrekte Prozessierung der viralen Proteine konnte nachgewiesen werden. Durch Elektronenmikroskopie wurde bestätigt, dass HERV-K 108 virale Partikel mit charakteristischen Strukturen der Hüllproteine produziert. Diese Partikel enthalten virale Volllängen RNA-Genome. Da HERV-K 108 in der Linie UKRV Mel 2-C9 eine Mutation im aktiven Zentrum der Reversen Transkriptase zeigt, sind die Partikel nicht infektiös. Um Einblicke in die der HERV-K Expression in Keimzelltumoren und Melanomen zu Grunde liegenden transkriptionellen Regulationsmechanismen zu erhalten, wurden mittels 5’ und 3’ RACE (rapid amplification of cDNA ends) der Transkriptionsstart und die Terminationsstelle bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass der HERV-K Promotor in den untersuchten Zelllinien TATA-unabhängig agiert obwohl die HERV-K LTR (long terminal repeat) ein TATA-Motiv aufweist. Die transkriptionelle Aktivität des HERV-K Promotors ist abhängig von einer GC-Box in unmittelbarer Nähe zu einem Initiatorelement am Startpunkt der Transkription. Das GC-Sequenzmotiv ist die Bindestelle für die Transkriptionsfaktoren SP1 (specific protein) und SP3. Mutationen des Bindemotivs führten zu einem drastischen Abfall der Promotoraktivität im Luziferaseassay. Durch Proteinknockdown mittels spezifischer siRNA gegen SP1 und SP3 konnte die Promotoraktivität ebenso deutlich reduziert werden. Elektrophoretic mobility shift assays und Chromatinimmunopräzipitationen bestätigten eine Bindung von SP1 und SP3 an die HERV-K LTR. Die Transkriptionsfaktoren SP1 und SP3 sind an der Initiation der basalen Transkription von HERV-K maßgeblich beteiligt.
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Human endogenous retroviruses (HERVs) resulted from germ line infections of primate ancestors. At present most HERV families are defective but some proviruses of the HERV-K/HML-2 family have maintained open reading frame
Human endogenous retroviruses (HERVs) resulted from germ line infections of primate ancestors. At present most HERV families are defective but some proviruses of the HERV-K/HML-2 family have maintained open reading frames for all viral proteins. Although usually strictly repressed, HERV-K transcription and translation is re-activated in germ cell tumours and melanoma. For these types of cancer HERV-K is a diagnostic and prognostic marker. We aim to understand the transcriptional regulation of HERV-K. The transcriptional start and termination sites were identified by 5' and 3’-rapid amplification of cDNA ends. The impact of specific transcription factors on the HERV-K LTR was analyzed using luciferase reporter assays, mutational and siRNA approaches, chromatin immuno-precipitation assays (ChIP) and electrophoretic mobility shift assays (EMSA). We demonstrate that the HERV-K LTR is a TATA independent promoter despite the presence of a TATA motif. Mutation of this motif did not abrogate promoter activity. Transcription initiation is mediated by a GC-box, the binding motif of the transcription factors SP1 (specificity protein) and SP3, located near an initiator element. Mutation of the GC-box significantly reduced HERV-K promoter activity as did a knock down of the Sp1 and Sp3 proteins. EMSA and ChIP confirmed that the GC-box represents a binding site for the transcription factors Sp1 and Sp3.
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Metadaten
Author:Nina Verena Fuchs
URN:urn:nbn:de:hebis:30-86475
Referee:Rolf Marschalek
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/12/08
Year of first Publication:2009
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2010/12/01
Release Date:2010/12/08
Tag:Endogene Retroviren; HERV-K ; LTR ; Transkriptionssteuerung ; reaktivierte Proviren
HERV-K ; LTR ; Transcriptioncontrol ; edogenous retroviruses ; reactivated proviral loci
SWD-Keyword:Endogene Retroviren ; Genregulation ; Melanom ; Promotor <Genetik>
HeBIS PPN:229354114
Institutes:Pharmazie
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

$Rev: 11761 $