Toll-like receptor-mediated regulation of Leukotriene biosynthesis in human monocytes

Toll-like Rezeptor-vermittelte Regulation der Leukotrien-Biosynthese in menschlichen Monozyten

  • Leukotrienes (LTs) are pro-inflammatory lipid mediators that belong to the group of eicosanoids, which are oxygenated metabolites of one common precursor, the aracidonic acid (AA). This polyunsaturated fatty acid is esterified at the sn-2 position of cellular membrane phospholipids and can be released by cytosolic phospholipase A2 alpha (cPLA2alpha) enzymatic deacylation. AA can be converted into LTs by the catalytic reaction of 5-lipoxygenase (5-LO). Enzymatic activation of cPLA2alpha as well as of 5-LO is regulated by similar determinants. In response to cellular stimuli that elevate the intracellular Ca2+ level and/or activate MAP kinase pathways, cPLA2alpha and 5-LO comigrate from a soluble cell compartment (mainly the cytosol) to the nuclear membrane, where AA is released und converted into LTs. LTs play a significant role in promoting inflammatory reactions and immune processes. They have been shown to be released from leukocytes in response to bacterial and viral infections and substantially contribute to an effective immune reaction for host defense. Innate immune pathogen recognition is mediated to a substantial part by the Toll-like receptor (TLR) family. So far, 10 human TLR subtypes have been identified, all of which detect distinct highly conserved microbial structures and trigger the induction of signaling pathways that lead to the expression of numerous immune and inflammatory genes. TLR signaling culminates in the activation NF-kappaB and/or MAP kinases, which as well are known to be involved in the regulation of cellular LT biosynthesis. In this regard, it seemed conceivable that the release of LTs might be regulated by TLR activation. Present studies were undertaken in order to verify and characterize a possible influence of TLR activation on the LT biosynthesis, and furthermore to identify the involved signaling pathways and underlying mechanisms. First experiments revealed that pre-incubation of differentiated Mono Mac 6 (MM6) cells with a TLR4 ligand, a TLR5 ligand, as well as with different TLR2 ligands led to an about 2-fold enhancement of Ca2+ ionophore induced LT biosynthesis. Ligands of other TLR subtypes did not show any influence. These observations could also be confirmed in primary human monocytes stimulated with ionophore or fMLP. With focus on TLR2 ligands, further studies were carried out to characterize the observed enhancement of LT biosynthesis in MM6 cells. It was demonstrated that the extent of LT formation was dependent on the ligand concentration used, but was also dependent on the duration of pre-incubation. Ligand pre-incubation of 15 minutes was optimal to maximally enhance LT formation and further prolongation of pre-incubation decreased LT formation again. Moreover, simultaneous addition of TLR2 ligands with ionophore did also not enhance LT formation. These results indicated that TLR2 ligands seemed to prime human monocytes for an enhanced response upon ionophore stimulation, but did not act as costimuli, which per se were not capable of directly stimulating the biosynthesis of LTs. To analyze the underlying mechanism, the impact of TLR2 ligands on the two key enzymes of the LT biosynthesis pathway, cPLA2alpha and 5-LO, was investigated. In this regard, 5-LO could not been shown to be positively regulated by TLR ligand priming. Neither a direct stimulation, nor an enhancement of 5-LO activity by TLR ligands was detectable in MM6 cells. Similarly, TLR2 ligands did also not enhance ionophore induced 5-LO translocation to the nuclear membrane. However, it was shown that TLR2 ligands enhanced ionophore induced release of AA in MM6 cells, which occurred with a similar time course as LT formation, displaying a maximum at 10 minutes of pre-incubation. A direct stimulation of AA release, however, could not been detected. Inhibitor studies revealed cPLA2alpha to be essential for AA release in TLR2 ligand primed, ionophore stimulated MM6 cells, but also sPLA2 was found to be involved. However, the priming effect of TLR2 ligands was mediated exclusively by cPLA2alpha. Western Blot analyses revealed that p38 MAP kinase, as well as ERK1/2, are activated in MM6 cells in response to TLR2 ligands, and also Ser-505 phosphorylation of cPLA2alpha was detected, which is known to be mediated by MAP kinases and to increase cPLA2alpha activity in vitro. Maximal cPLA2alpha phosphorylation occurred after 5-10 minutes of TLR2 ligand incubation, slightly preceding maximal AA release at 10 minutes and maximal LT formation at 15 minutes of priming. The combined use of a specific p38 MAPK inhibitor with an inhibitor of the ERK1/2 signaling pathway resulted in a complete prevention of cPLA2alpha phosphorylation and TLR2 ligand mediated enhancement of AA release. Thus, both MAPK pathways seem to play a role for TLR2 ligand mediated priming effects on the release of AA. An impact of other kinases such as Mnk-1 and CamKII, which can also regulate cPLA2alpha by phosphorylation, was excluded. Finally, an anti-hTLR2 antibody significantly reduced enhanced AA release, confirming the priming effects to be dependent on TLR2 activation. In summary, it was concluded that the increase of LT biosynthesis by TLR2 ligand priming is considerably due to an enhanced cellular AA supply, which arises from a MAPK mediated phosphorylation and up-regulation of cPLA2alpha. TLR dependent enhancement of LT biosynthesis represents an interesting link between activation of innate immune receptors and the rapid formation of pro-inflammatory lipid mediators. On the one hand, this support the role of LTs in host defence and infectious diseases, but may also be relevant in pathophysiological processes, which involve TLRs as well as LTs, as it has been shown for the pathogenesis of atherosclerosis or allergic diseases.
  • Leukotriene (LTs) sind Entzündungsmediatoren aus der Gruppe der Eikosanoide, welche sich von der Arachidonsäure (AA) als ihre gemeinsame Vorstufe ableiten. Diese mehrfach ungesättigte Fettsäure ist in der Zelle in Membranphospholipiden verestert, und kann enzymatisch durch die zytosolische PLA2alpha (cPLA2alpha) freigesetzt werden. Weiterhin wird die AA durch die 5-Lipoxygenase (5-LO) zu LTs umgesetzt. 5-LO und cPLA2alpha sind sehr ähnlich reguliert. Zelluläre Stimuli, die zu einer Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration und/oder Aktivierung von Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPKs) führen, lösen eine Aktivierung, und die konzertierte Translokation beider Enzyme aus dem Zytosol zur Kernmembran aus, wo die Freisetzung der AA und die LT-Biosynthese erfolgt. LTs spielen eine wichtige Rolle in Entzündungsreaktionen und Immunprozessen. Sie werden von Leukozyten bei bakteriellen und viralen Infektionen gebildet, und tragen zur Aktivierung entsprechender Immunabwehrmechanismen bei. Toll-like Rezeptoren (TLRs) sind Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, die eine Schlüsselrolle für die Detektion von Pathogenen im Organismus spielen. Sie erkennen hoch konservierte pathogen-assoziierte molekulare Strukturen und aktivieren Signaltransduktionswege, die zur Expression entzündungsrelevanter Proteine und somit zur Entwicklung einer Immunantwort führen. Die TLR-Aktivierung führt im Allgemeinen zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kappaB, und zur Aktivierung von MAP-Kinasen, deren Rolle in der Regulation der LT-Biosynthese bereits erwähnt wurde. Vor diesem Hintergrund schien es denkbar, dass im Zuge einer TLR-Aktivierung auch eine Regulation der LT-Bildung erfolgen könnte. Ziel dieser Arbeit war es, diesen Zusammenhang zu verifizieren, den Einfluss von TLR-Liganden auf die Biosynthese von LTs zu charakterisieren und die zugrundeliegenden Mechanismen aufzuklären. Erste Versuche zeigten, dass die Vorbehandlung differenzierter Mono Mac 6 (MM6)-Zellen mit einem TLR4-, einem TLR5- und mit verschiedenen TLR2-Liganden zu einer Verdopplung der LT-Biosynthese führte, die durch Ca2+-Ionophor stimuliert worden war. Die Liganden anderer TLR-Subtypen zeigten dagegen keine Wirkung. Der verstärkende Effekt der TLR2-Liganden konnte in primären humanen Monozyten ebenfalls bestätigt werden. In Folgeexperimenten zur Charakterisierung des beobachteten Effektes in MM6-Zellen war die verstärkende Wirkung der TLR2-Liganden abhängig von der eingesetzten Konzentration und der Vorinkubationszeit. Eine 15-minütige Vorbehandlung mit den Liganden erwies sich als optimal, während eine Verlängerung der Inkubationsdauer zum Verschwinden des Effektes führte. Wurden die TLR2-Liganden zusammen mit Ionophor inkubiert, war ebenfalls keine Verstärkung der LT-Bildung messbar. Diese Beobachtungen führten zu der Annahme, dass die TLR2-Liganden zwar als Priming-Agenzien in der Lage sind, die Stimulation der LT-Bildung zu verstärken, selbst jedoch nicht direkt aktivieren können. Zur Aufdeckung des zugrundeliegenden Mechanismus wurde der Einfluss der TLR2-Liganden auf die cPLA2alpha und auf die 5-LO untersucht. Für die 5-LO ließ sich keine positive Regulation durch Priming von MM6-Zellen mit TLR2-Liganden nachweisen: es konnte keine Stimulation, und keine Verstärkung der Ionophor-induzierten 5-LO-Aktivität detektiert werden. Weiterhin bewirkten die TLR2-Liganden keine Verstärkung der 5-LO-Translokation zur nukleären Membran. Dagegen konnte gezeigt werden, dass TLR2-Liganden in MM6-Zellen die Ionophor-induzierte AA-Freisetzung verstärken. Hierbei war, wie für die LT-Bildung, eine Zeitabhängigkeit des Effektes mit einer optimalen Vorinkubationszeit der Liganden von etwa 10 Minuten feststellbar. Eine direkte Stimulation der AA-Freisetzung durch die TLR2-Liganden erfolgte nicht. In Inhibitor-Studien stellte sich heraus, dass sowohl die cPLA2alpha als auch sPLA2 an der AA-Freisetzung in geprimten MM6-Zellen beteiligt sind. Der Verstärkungseffekt der Liganden war jedoch allein durch die cPLA2alpha vermittelt. Weiterhin konnte in MM6-Zellen nach Inkubation mit TLR2-Liganden sowohl die Aktivierung der p38 und der p42/44 MAP-Kinase (ERK1/2), als auch die Phosphorylierung der cPLA2alpha an Ser-505 nachgewiesen werden, welche durch MAP-Kinasen erfolgt, und in vitro zur Aktivitätssteigerung der cPLA2alpha führt. Nach etwa 5-minütiger Behandlung riefen die Liganden maximale Phosphorylierung hervor, die somit einer maximalen AA-Freisetzung bei 10-minütigem Priming und einer maximalen LT-Bildung bei 15-minütigen Priming vorauszugehen schien. Die Kombination von Inhibitoren des p38 und des p42/44 MAP-Kinase Signalweges führte zur vollständigen Aufhebung sowohl der beobachteten cPLA2alpha-Phosphorylierung, als auch der Verstärkung der AA-Freisetzung. Beide MAP-Kinasewege scheinen somit eine Rolle für diesen Verstärkungseffekt der TLR2-Liganden zu spielen. Der Einfluss weiterer für die Regulation der cPLA2alpha relevanter Kinasen (Mnk-1 und CamKII) konnte ausgeschlossen werden. Abschließend wurde gezeigt, dass die beobachtete Steigerung der AA-Freisetzung durch Aktivierung des TLR2 vermittelt wird. Die TLR2-vermittelte Verstärkung der LT-Biosynthese in MM6-Zellen ist somit hauptsächlich auf eine vermehrte AA-Freisetzung zurückzuführen, die wiederum aus der cPLA2alpha-Phosphorylierung durch MAP-Kinasen und der dadurch verstärkten cPLA2alpha-Aktivierung resultiert. Die TLR-abhängige Verstärkung der LT-Bildung stellt einen interessanten Zusammenhang zwischen der Aktivierung von Rezeptoren des angeborenen Immunsystems und der kurzfristigen Freisetzung von Entzündungsmediatoren dar, der die Bedeutung der LTs für die Immunabwehr einmal mehr unterstreicht.

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Metadaten
Author:Sabine Christa Lindner
URN:urn:nbn:de:hebis:30-85350
Referee:Dieter SteinhilberORCiDGND
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2010/11/19
Year of first Publication:2010
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2010/10/08
Release Date:2010/11/19
Tag:Leukotrienes; Toll-like receptors; biochemistry; dissertation; immune system; inflammation
GND Keyword:Leukotriene; Toll-like-Rezeptoren; Dissertation; Biochemie; Entzündung; Immunsystem
HeBIS-PPN:228899605
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Pharmazie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 54 Chemie / 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht