Open Access

Santosh Kumar Mishra

• Studies in particular of the last decade showed that active neurogenesis continuously takes place in the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles of the adult rodent brain. Neurogenesis in the SVZ leads to migration of neuroblasts within the rostral migratory stream (RMS) and mature neuron formation mainly in the olfactory bulb (OB). According to present understanding, glial cells with astrocytic properties represent the actual adult neural stem cells. The cell types representing the various cellular transition states leading to the formation of mature neurons as well as the mechanisms controlling adult neurogenesis and neuroblast migration are poorly understood. A previous study from this laboratory demonstrated that the ATP-hydrolyzing enzyme nucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2 (NTPDase2) is associated with type B cells, the presumptive neural stem cells. NTPDase2 is a protein of the plasma membrane with its catalytic site facing the extracellular space. It hydrolyzes extracellular nucleoside triphosphates to their respective nucleoside diphosphates. This raises the possibility that the signaling pathway via extracellular nucleotides is involved in the control of adult neurogenesis. Neurons as well as glial cells express several subtypes of receptors (P2 receptors) that are responsive to the nucleotides ATP, ADP, UTP, or UDP. P2X receptors are ATP-gated Na+, K+ and Ca2+ permeable ion channels, P2Y receptors are coupled to trimeric G-proteins. In order to probe for a functional role of nucleotides in adult neurogenesis, the present study referred to an in vitro system (neurospheres). Neurospheres produced from isolates of the mouse SVZ and cultured in the presence of EGF and bFGF expressed the neural stem cell marker nestin and also GFAP, S100β, NTPDase2 and tissue non-specific alkaline phosphatase. Neurospheres generated from the cells of the subventricular zone were multipotenital. This was revealed by immunostaining of differentiated cells with markers for astrocytes, neurons and oligodendrocytes. The presence of ecto-nucleotidase was verified by analyzing the free phosphate released from nucleotides. The tissue non-specific form of alkaline phosphatase was the predominant enzyme. Both NTPDase2 and TNAP could be identified by immunocytochemistry and Western blotting. Hydrolysis was not observed for p-nitrophenyl thymidine monophosphate, a substrate of members of the ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family (NPP1 to NPP3). Since ecto-nucleotidases control the availability of extracellular nucleotide agonists, neurospheres were studied for the potential expression and functional role of nucleotide receptors. Neurospheres responded to extracellular nucleotides with a transient rise in Ca2+ (ATP = ADP > UTP). The rise in Ca2+ was due to P2Y receptors. The Ca2+ response was unaltered in the absence of extracellular Ca2+ and strongly reduced by thapsigargin, a blocker of internal Ca2+ stores. The P2Y1 antagonist MRS2179 strongly reduced the ATP- or ADP-induced increase in Ca2+, suggesting the involvement of a P2Y1 receptor. In addition, suramin and PPADS, non-selective antagonists for P2 receptors, inhibited most of the Ca2+ response. The agonistic activity of UTP and the lack of response to UDP implied the additional presence of a P2Y2 and/or a P2Y4 receptors and the absence of a functional P2Y6 receptor. RT-PCR experiments demonstrated that neurospheres expressed P2Y1 and P2Y2 receptors but not P2Y4 receptor. That the majority of the Ca2+ response to ATP was mediated via P2Y1 receptors was also confirmed by analysis of P2Y1 knockout mice and by application of the P2Y1 receptor-specific antagonist MRS2179. In addition, agonists of P2Y1 and P2Y2 receptors and low concentrations of adenosine augmented cell proliferation inspite of the presence of mitogenic growth factors. Neurosphere cell proliferation was attenuated after application of MRS2179 and in neurospheres from P2Y1 receptor knockout mice. These results infer a nucleotide receptor-mediated synergism that augments growth factor-mediated cell proliferation. Taken together these results suggest that P2Y-mediated nucleotidergic signalling is involved in neurosphere function and possibly also in adult neurogenesis in situ.
• Untersuchungen, insbesondere der letzten Dekade, zeigten überzeugend, dass aktive Neurogenese innerhalb der subventrikulären Zone (SVZ) der Seitenventrikel der Nager fortlaufend stattfindet. Die Neurogenese innerhalb der SVZ führt zur Wanderung der gebildeten Neuroblasten innerhalb des sog. rostralen Migrationsstroms und schließlich zur Neubildung reifer Nervenzellen im Bulbus olfactorius. Nach gegenwärtigem Verständnis stellen Gliazellen mit astrozytären Eigenschaften die eigentlichen Stammzellen dar. Wenig verstanden sind die Zelltypen, die die diversen Übergangsstadien der Neuronenbildung darstellen sowie die Mechanismen, die die adulte Neurogenese und die Wanderung der Neuroblasten kontrollieren. Eine vorausgehende Studie aus diesem Labor hatte zunächst gezeigt, dass das ATP-hydrolysierende Enzym Nukleosidtriphosphat-Diphosphohydrolase2 (NTPDase2) mit den Typ-B-Zellen assoziiert ist, den putativen Stammzellen der SVZ. NTPDase2 ist ein membranständiges Protein, dessen katalytische Domäne in den extrazellulären Raum weist. Es hydrolysiert Nukleosidtriphosphate zu den entsprechenden Nukleosiddiphosphaten. Dieser Befund weist darauf hin, dass nukleotiderge Signalwege eine Rolle bei der Kontrolle der adulten Neurogenesse spielen könnten. Neurone und auch Gliazellen exprimieren verschied ene Nukleotidrezeptoren (P2-Rezeptoren), die auf Nukleotide wie ATP, ADP, UTP oder UDP reagieren. P2X-Rezepotoren stellen Na+, K+ und Ca2+-permeable, ATP-aktivierte Ionenkanäle dar. P2Y-Rezeptoren sind dagegen an trimere G-Proteine gekoppelt. Um eine mögliche funktionelle Rolle von Nukleotiden bei der adulten Neurogenese weiter zu evaluieren, wurde in dieser Studie ein in vitro-System eingesetzt (Neurosphären). Neurosphären wurden aus der SVZ der Seitenventrikel der Maus in Gegenwart der mitogenen Wachstumsfaktoren EGF und bFGF gewonnen. Die in den Neurosphären enthaltenen Stammzellen konnten sich vermehren waren multipotent. Alle Neurosphären waren immunpositiv für die Typ-B-Zell-Marker NTPDase2, GFAP und S100β sowie den Stammzellmarker Nestin. Kultivierte Neurosphären enthielten wenige Zellen mit langen Fortsätzen, die immunpositiv für den frühen Neuronenmarker βIII-Tubulin waren. Dies legt eine partiell beginnende neuronale Differenzierung innerhalb der kultivierten Neurosphären nahe. Die Multipotenz der Neurosphärenzellen wurde mittels immunzytologischer Untersuchungen gezeigt. Nach Entzug der Wachstumsfaktoren und Zugabe von Serum begannen sich die Zellen zu differenzieren. Im Vergleich zur Gesamtzahl der Zellen (DAPI-Färbung der Zellkerne), erwiesen sich 42% der Zellen als GFAP-positive Astrozyten, 22% als βIII-Tubulin-positive frühe Neuronen und 21% als O4-exprimierende Oligodendrozyten. Entsprechende Ergebnisse wurden mit primären und sekundären Neurosphären erhalten. Die Aktivität von Ekto-Nukleotidasen wurde über die Bildung freien Phosphats nach Hydrolyse von ATP, ADP und AMP bestimmt. Da NTPDase2 eine hohe Präferenz für die Hydrolyse von ATP besitzt, AMP gar nicht und ADP nur marginal hydrolysiert, legten die Ergebnisse nahe, dass NTPDase2 entweder nicht auf Neurosphären exprimiert wird oder dass eine andere Ekto-Nukleotidase für die beobachtete Hydrolyse verantwortlich ist. Da embryonale Stammzellen alkalische Phosphatase exprimieren, ein Enzym welches ATP, ADP und AMP hydrolysiert, wurde die mögliche Expression dieses Enzyms überprüft. Neurosphären hydrolysierten p-Nitrophenylphosphat, ein spezifisches Substrat der alkalischen Phosphatase. Von den vier Subtypen dieses Enzyms wird nur die sog. Gewebe-unspezifische Form (TNAP) effektiv durch Levamisol gehemmt. Levamisol (1 mM) inhibierte die ATP-Hydrolyse um 82%. Dies legt nahe, dass NTPDase2 weniger als 20% zur ATP-Hydrolyse der Neurosphären beiträgt. Keine Hydrolyseaktivität ergab sich nach Applikation von p-Nitrophenyl-Thymidinmonophosphat, einem Substrat von Ekto-Nukleotidpyrophosphatasen/Phosphodiesterasen (NPP1 bis NPP3). Das Vorkommen von NTPDase2 und TNAP wurde mittels Immunzytologie, im Western-Blot und durch RT-PCR bestätigt. Diese Daten belegen, dass Neurosphären die Ekto-Nukleotidasen NTPDase2 und TNAP exprimieren und dass TNAP das katalytisch dominierende Enzym ist. In weiteren Experimenten wurde gezeigt, dass Neurosphären nicht nur Ekto-Nukleotidasen sondern auch funktionelle P2-Rezeptoren exprimieren. Da mehrere P2Y-Rezeptoren an die PhospholipaseCβ gekoppelt sind, wurden nach Fura-2-Beladung von Neurosphären Ca2+-Imaging-Versuche durchgeführt. Neurosphären antworteten auf ATP und ADP gleich gut mit einer transienten Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration. UTP war weniger wirksam und UDP unwirksam. Dieses Antwortverhalten wäre prinzipiell kompatibel mit einer Beteiligung von P2X und P2Y-Rezeptoren. Wegen der Vielfalt an P2X- und P2Y-Rezeptoren wurden verschiedene Agonisten untersucht, wie ADPβS, 2MSADP, 2 ClATP, 2MSATP (Agonisten von P2Y1-Rezeptoren), α,βmeATP (P2X1, P2X3), βγmeATP (P2X3), BzATP (P2X7), UDP-Glucose (P2Y14) und auch Adenosin für P1-Rezeptoren. Alle P2Y1-Agonsiten lösten eine robuste Ca2+-Antwort aus, während die anderen Agonisten unwirksam waren. Um eine Beteiligung von weiteren P2X-Rezeptoren auszuschließen, wurde die Ca2+-Antwort in Anwesenheit und Abwesenheit von extrazellulärem Ca2+ verglichen. Fehlen von extrazellulärem Ca2+ ergab keine Reduktion der Ca2+-Antwort. Dies legte eine ausschließliche Beteiligung intrazellulärer Ca2+-Speicher nahe. Entsprechend resultierte die Applikation von Thapsigargin, einem Blocker intrazellulärer Ca2+-Speicher, in einer starken Reduktion der Ca2+-Antwort auf ATP und ADP. Diese Ergebnisse zeigen, dass die intrazelluläre Ca2+-Antwort auf eine Freisetzung aus internen Speichern zurückzuführen war. Die Beteiligung des ATP- und ADP-sensitiven P2Y1-Rezeptors wurde weiterhin untermauert durch die hemmende Wirkung des P2Y1-Antagonisten MRS2179. Der Antagonist reduzierte die Antwort auf ATP und ADP. Die nicht-selektiven P2-Rezeptor-Blocker Suramin und PPADS inhibierten dagegen die ATP-, ADP- und die UTP induzierte Ca2+-Antwort. Die agonistische Wirkung von UTP und die Unwirksamkeit von UDP wiesen auf zusätzliche die Gegenwart von P2Y2- und/oder P2Y4-Rezeptoren sowie die Abwesenheit funktioneller P2Y6-Rezeptoren hin. Entsprechend unserer RT-PCR-Daten (Diplomarbeit von M. Füllgrabe, 2005) enthalten Neurosphären mRNA für P2Y1 und P2Y2 aber nicht für P2Y4-Rezeptoren. Dies schließt einen Beitrag von P2Y4-Rezeptoren aus. Die funktionelle Bedeutung von P2Y1-Rezeptoren wurde durch Untersuchungen an P2Y1-Knockout-Mäusen weiter untermauert. Da diese Mäuse einen anderen genetischen Hintergrund aufwiesen (CB57BL/6J), wurde der entsprechende Wildtyp als Kontrolle eingesetzt. Die Neurosphären aus CB57BL/6J-Wild-Typ-Mäusen zeigten das gleiche Muster evozierter Ca2+-Antworten wie die ursprünglich untersuchten C57BL/6N-Mäuse (ATP=ADP>UTP>>>UDP). Die P2Y1-Kockout-Maus enthielt dagegen funktionelle P2Y2-Rezeptoren. Entsprechend wurden durch ATP und UTP gleich große Ca2+-Antworten evoziert. Vernachlässigbare Antworten ergaben sich nach Applikation von ADP und UDP. Dies belegt die Abwesenheit der P2Y1-Rezeptoren aber auch von P2Y6-Rezeptoren in den Knockout-Tieren. Die bisherigen Ergebnisse induzierten die Frage nach der physiologischen Bedeutung der P2Y1- und P2Y2-Rezeptoren in den kultivierten Neurosphären. Daher wurde ein möglicher Einfluss dieser Rezeptoren auf die Zellproliferation untersucht. Dazu wurden die Neurosphären sieben Tage nach Kultivierung dissoziiert. Anschließend wurde den Zellen täglich Nukleotid zugegeben. Nach weiteren vier Tagen wurde die Zellzahl bestimmt. In Voruntersuchungen stellte sich heraus, dass die Zugabe von Agonisten für P2Y1- und P2Y2-Rezeptoren die Zellproliferation bei den vorgegeben hohen Konzentrationen an Wachstumsfaktoren nicht veränderten (20 ng/ml für EGF und 10 ng/ml für bFGF). Daher wurde die Konzentration der Wachstumsfaktoren reduziert (auf 5 ng/ml für EGF, bzw. 2.5 ng/ml für bFGF). Die Reduktion der Wachstumsfaktorkonzentration hatte keinen Einfluss auf die Zellproliferation. Daher wurden weitere Untersuchungen mit der erniedrigten Konzentration durchgeführt. Applikation des P2Y1-Rezeporagonisten ADPβS oder des P2Y2-Rezeptor Agonisten UTP resultierte dann in einer Stimulation der Zellproliferation. Ko-Applikation stimulierte die Proliferation zusätzlich. Keine Wirkung auf die Zellproliferation ergab sich erwartungsgemäß nach Applikation des P2Y6-Rezeptor-Agonisten UDP oder der P2X-Rezeptor-Agonisten α,βmeATP oder BzATP. Weiterhin erwies sich der P2Y1-Rezeporagonist ADPβS unwirksam an Neurohsphären aus P2Y1-Rezeptor-Knockout-Mäusen. Dagegen erhöhte UTP die Zellzahl in diesen Neurosphären, was die erwartete Präsenz des P2Y2-Rezeptors belegt. Im Gegensatz zu den Neurosphären aus Wildtyp-Mäusen ergab sich bei Ko-Appliaktion von ADPβS und UTP keine weitere Erhöhung der Zellproliferation. Interessanterweise blockierte Adenosin bei hohen Konzentrationen (10 und 50 μM) die Ausbildung von Neurosphären. Dagegen stimulierte es bei einer Konzentration von 1 μM die Zellproliferation. Der Adenosinrezeptor-Agonist NECA stimulierte dagegen bei einer Konzentration von 50 μM die Zellproliferation in Neurosphären. Überraschenderweise inhibierten auch 50 μM ATP oder ADP die Zellproliferation. Dieser Effekt wurde durch die Applikation des Adenosintransport-Inhibitors NBTI (1 μM) reduziert. Dies legt nahe, dass die beiden Nukleotide extrazellulär zu Adenosin hydrolysiert werden und dass das gebildete Adenosin bei erhöhten Konzentrationen seine Wirkung intrazellulär und nicht über Rezeptoren der Plasmamembran induziert. Bei niedrigen Konzentrationen wirkt es jedoch gleichsinnig zu P2Y1-Rezeptoragonisten. Diese Ergebnisse legten die Möglichkeit nahe, dass Nukleotide von Zellen der Neurosphären konstitutiv freigesetzt werden und dass sie eine autokrine oder parakrine Wirkung entfalten, wobei sie die Wachstumsfaktor-induzierte Zellproliferation über P2Y-Rezeptoren synergistisch steigern. Daher wurden die Zellproliferation zusätzlich in Neurosphären aus P2Y1-Knockout-Mäusen und dem entsprechenden Wildtyp (C57BL/6J) untersucht. Zwischen den beiden untersuchten Wildtypen (C57BL/6N und C57BL/6J) ergab sich kein Unterschied in der Zellproliferation. Dagegen war die Zellzahl in Neurosphären aus P2Y1-Rezeptor-Knockout-Mäusen vier Tage nach Zelldissoziation um 53% reduziert. Weiterhin wurde die Wirkung des P2Y1-Rezeptor-Antagonisten MRS2179 (50 μM) auf die Zellproliferation von Neurosphären aus Wildtyp-Mäusen untersucht. Dieser Antagonist führte ebenfalls zu einer Reduktion der Zellproliferation. Beide Ergebnisse sprechen dafür, dass – ohne weitere externe Aktivierung - endogen freigesetztes ATP P2Y1-Rezeptoren konstitutiv stimuliert. Gegenwärtig gibt es keinen spezifischen Antagonisten für den P2Y2-Rezeptor. Daher konnten entsprechende Untersuchungen nicht durchgeführt werden. Die Resultate sprechen jedoch stark dafür, dass endogen freigesetztes ATP in Gegenwart der mitogenen Wachstumsfaktoren EGF und bFGF über P2Y1-Rezeptoren die Zellproliferation stimulieren kann. Insgesamt stützen die vorgelegten Untersuchungen die Vorstellung, dass endogen freigesetzte Nukleotide und Nukleoside über Rezeptor-induzierte Mechanismen zur Kontrolle der adulten Neurogenese beitragen.