Open Access

Gerold Höver

• Zur Zeit basiert die Behandlung der Infektion mit dem Humanen-Immunschwäche-Virus (HIV) ausschließlich auf einer Chemotherapie, die das Virus nicht eradiziert, sondern in seiner Vermehrung hemmt. Diese Therapie muß lebenslang erfolgen. Die Wirksamkeit der Medikamente ist, auch in einer Kombinationstherapie, durch die Entwicklung von Resistenzen limitiert. Diese begründet sich zum einen in der Selektion resistenter Virusmutanten. Zum anderen weisen experimentell und in Studien gewonnene Ergebnisse auf die Beteiligung zellulärer Faktoren am Therapieversagen hin. Über die Rolle zellulärer Prozesse bei der Resistenzentwicklung gegen die in der HIV-1 Therapie eingesetzten Nukleosidalen-Reverse-Transkriptase-Inhibitoren ist jedoch noch wenig bekannt. NRTIs sind Prodrugs und werden durch zelleigene Kinasen aktiviert. Eine verminderte Expression oder Aktivität dieser Kinasen kann zu subtherapeutischen intrazellulären Wirkspiegeln führen. In der vorliegenden Arbeit wurden anhand einer T-lymphoiden Zellkultur (H9) die zellulären Mechanismen, die nach einer langdauernden Zidovudin (AZT) Exposition eine zelluläre AZT-Resistenz bewirken, und Methoden diese Resistenz zu umgehen bzw. zu verhindern, untersucht. Es zeigte sich, daß die kontinuierliche AZT-Exposition eine verminderte Expression der Thymidinkinase 1 (TK1) bewirkt. Dies führt zu einer verminderten AZT-Phosphorylierung und letztendlich zu geringeren Wirkstoffspiegeln des antiretroviral wirksamen Metaboliten AZT-Triphosphat (AZT-TP). In AZT resistenten H9 Zellen zeigte AZT eine verminderte Zytotoxizität, und eine um mehr als den Faktor 1000 verminderte antiretrovirale Aktivität. Als mögliche Ursachen für die verminderte Expression der TK1 wurden die DNA-Methylierung und die Histon-Deacetylierung, zwei Faktoren, die Hand in Hand die Genexpression auf transkriptioneller Ebene beinflussen, untersucht. AZT resistente Zellen zeigten in immunzytochemischen Färbungen eine starke Histon-Deacetylierung. Die Behandlung resistenter Zellen mit Trichostatin A (TSA), einem Hemmstoff der Histon-Deacetylierung führte jedoch nicht zu einer Erhöhung der TK1 mRNA-Spiegel. Die Behandlung resistenter Zellen mit 5-AZA-C, einem Inhibitor der Methyltransferase 1 (DNMT1) erhöhte sowohl die Expression der TK1 als auch die Zytotoxizität und die antiretrovirale Aktivität von AZT. Darüber hinaus verminderte die gleichzeitige Behandlung von H9 Zellen mit AZT und 5-AZA-C die Resistenzentwicklung gegen AZT erheblich. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß in den AZT resistenten Zellen die Expression der „de novo“ Methyltransferasen 3a und 3b (DNMT3a / 3b) erhöht ist. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß eine „de novo“ Methylierung des TK1-Gens durch die DNMT3a und DNMT3b die Ursache für die verminderte TK1 Expression in AZT resistenten H9 Zellen ist. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit gezeigt, daß einige amphiphile Heterodinukleosidphosphate, die nach intrazellulärer Spaltung monophosphorylierte Nukleosidanaloga freisetzen, die AZT Resistenz überwinden können. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen vermuten, daß eine spezifische Hemmung der „de novo“ Methyltransferasen oder der Einsatz monophosphorylierter Substanzen die Wirksamkeit einer antiretroviralen Therapie erheblich verbessern können, indem sie zelluläre Faktoren, die eine Phosphorylierung von AZT vermindern und dadurch zum Versagen von AZT als antiretroviralem Therapeutikum führen, unterdrücken bzw. umgehen.
• At present, the only strategy in clinical treatment of the HIV infection is a longterm chemotherapy using a combination of nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTIs), non nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) and protease inhibitors (PIs). A common problem in the long-term antiviral therapy is the failure of a drug regime after initial effectivity. The main cause of this failure is the development of viral resistance to these drugs. Another mechanism responsible for the failure of antiretroviral therapy in particular with NRTIs is a decrease in the metabolic activation of these substances. Since NRTIs are prodrugs which must be converted into their functionally active forms 5´-triphosphate, a decreased expression of nucleoside kinases will lead to a decreased level of the functionally active drug. In the present work the effects of a continuous treatment of a T-lymphoid cell line (H9) with the NRTI 3´-azido-,3´-deoxythymidine (AZT) were observed. It is shown that long-term treatment of this cells with AZT results in decreased thymidine kinase 1 (TK1) gene expression and that the inability of the cell to convert AZT into its triphosphate leads to a loss of cytotoxicity and antiretroviral activity of AZT. The role of DNA methylation and histone deacetylation as two closely linked mechanisms controlling gene expression were observed. Despite the strong histone deacetylation in AZT resistant cells, inhibition of histone deacetylases by trichostatin A had no effect on TK1 expression. In contrast the treatment of AZT resistant cells with 5-AZA-C upregulates the TK1 expression level enhancing the cytotoxicity and recovering the antiretroviral activity of AZT. Moreover a combined treatment of cells with AZT and 5-AZA-C does inhibit the development of AZT resistance. The development of resistance against AZT in H9 cells was found to be associated with increased mRNA levels of the “de novo” methyltransferases DNMT 3a and 3b while there was no change in “maintenance” methyltransferase DNMT1 gene expression. The observed overexpression of DNMT3a and 3b in AZT-resistant H9 cells is probably the reason for “de novo” methylation of the TK1 gene promoter region, leading to a decreased TK1 gene expression resulting in AZT resistance. This work also shows the efficacy of some amphiphilic heterodinucleoside phosphates in AZT resistant cells. These drugs are expected to release 5´-monophosphates after cellular uptake by means of enzymatic cleavage of the dimers. This work leads to the conclusion that a specific inhibition of the „de novo“ methyltransferases or the use of amphiphilic heterodinucleoside phosphates might improve the efficiency of an antiretroviral therapy by inhibiting or bypassing cellular factors leading to decreased levels of AZT-TP.