Biochemical and functional characterization of cell-free expressed G-protein coupled receptors of the human endothelin system

Biochemische und funktionelle Charakterisierung zellfrei exprimierter G-Protein-gekoppelter Rezeptoren des humanen Endothelin-Systems

  • G-protein coupled receptors (GPCRs) are the key players in signal perception and transduction and one of the currently most important class of drug targets. An example of high pharmacological relevance is the human endothelin (ET) system comprising two rhodopsin-like GPCRs, the endothelin A (ETA) and the endothelin B (ETB) receptor. Both receptors are major modulators in cardiovascular regulation and show striking diversities in biological responses affecting vasoconstriction and blood pressure regulation as well as many other physiological processes. Numerous disorders are associated with ET dysfunction and ET antagonism is considered an efficient treatment of diseases like heart failure, hypertension, diabetes, artherosclerosis and even cancer. This study exemplifies strategies and approaches for the preparative scale synthesis of GPCRs in individual cell-free (CF) systems based on E. coli, a newly emerging and promising technique for the production of even very difficult membrane proteins. The preparation of high quality samples in sufficient amounts is still a major bottleneck for the structural determination of the ET receptors. Heterologous overexpression has been a challenge now for decades but extensive studies with conventional cell-based systems had only limited success. A central milestone of this study was the development of efficient preparative scale expression protocols of the ETA receptor in qualities sufficient for structural analysis by using individual CF systems. Newly designed optimization strategies, the implementation of a variety of CF expression modes and the development of specific quality control assays finally resulted in the production of several milligrams of ETA receptor per one millilitre of reaction mixture. The versatility of CF expression was extensively used to modulate GPCR sample quality by modification of the solubilization environment with detergents and lipids in a variety of combinations at different stages of the production process. Downstream processing procedures of CF synthesized GPCRs were systematically optimized and sample properties were analysed with respect to homogeneity, protein stability and receptor ligand binding competence. Evaluation was accomplished by an array of complementary and specifically modified techniques. Depending on its hydrophobic environment, CF production of the ETA receptor resulted in non-aggregated, monodisperse forms with sufficient long-term stability and high degrees of secondary structure thermostability. The obtained results document the CF production of the ETA receptor in two different modes as an example of a class A GPCR in ligand-binding competent and non-aggregated form in quantities sufficient for structural approaches. The presented strategy could serve as basic guideline for the production of related receptors in similar systems.
  • G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), bilden mit etwa 3 % die größte Klasse an Zelloberflächenrezeptoren im menschlichen Proteom. Aufgrund ihrer bedeutenden Funktion bei der Verarbeitung vielfältiger Umweltsignale und bei der Steuerung physiologischer Abläufe im menschlichen Organismus gehören GPCRs mit rund 50 % zu den wichtigsten Angriffspunkten heutiger Arzneimittel. Ein Beispiel mit hoher pharmakologischer Relevanz ist das humane Endothelin- (ET) System, das aus zwei Rhodopsin-ähnlichen GPCRs, dem Endothelin A (ETA) und dem Endothelin B Rezeptor (ETB) besteht. Beide Rezeptoren gehören zu den wichtigsten Modulatoren des kardiovaskulären Systems. Es beeinflusst Gefäßverengung und Blutdruckregulation und spielt zudem eine essentielle Rolle bei Zellproliferation und Mitogenese. Viele bekannte Zivilisationskrankheiten sind mit endothelialer Fehlfunktion assoziiert. ET-Rezeptor-Antagonismus wird daher als potente Methode zur Behandlung von Herzinsuffizienz, Bluthochdruck, Diabetes, Atherosklerose und sogar von Krebs aufgefasst. Die Produktion von Proteinproben hoher Qualität in ausreichenden Mengen ist eine unabdingbare Voraussetzung zur strukturellen Aufklärung von GPCRs. Die heterologe Überexpression zur Herstellung der ET-Rezeptoren in konventionellen zell basierenden Systemen hatte allerdings bisher nur eingeschränkten Erfolg. Diese Arbeit konzentrierte sich daher auf die Anwendung alternativer Technologien, die auf selbst hergestellten zellfreien Expressionssystemen als hochkompetitive Option zur Produktion selbst schwieriger Membranproteine basieren. Das Hauptziel der vorliegenden Dissertation bestand in der Prozessentwicklung zur Etablierung individueller und effizienter zellfreier Syntheseprotokolle zur präparativen Produktion von GPCRs am Beispiel des humanen ET-Rezeptoms. Der Schwerpunkt wurde auf die zellfreie Produktion und Qualitätskontrolle des ETA Rezeptors gelegt, da hierzu noch keinerlei primäre Erkenntnisse vorlagen. Die erstellten Produktionsprozesse sowie die weitere Aufarbeitung des Rezeptors wurden systematisch im Detail optimiert. Ein wichtiger und neuartiger Ansatz war in diesem Hinblick die gezielte Modifikation der direkten Translationsumgebung des ETA Rezeptors, eine Möglichkeit die durch den charakteristischen Aufbau der zellfreien Reaktion geboten wird und bisher einzigartig für diese Technologie ist. Die Qualität der produzierten Proteine wurde nach schrittweisen Reaktionsmodifikationen und in Abhängigkeit der eingesetzten Expressionsmodi sowie von zugesetzten hydrophoben Additiven im Hinblick auf eine Reihe komplementärer Kriterien wie Homogenität, Stabilität und Ligandenbindungs-Kompetenz analysiert. Die spezifisch erarbeiteten Optimierungs¬strategien im Verbund mit den individuell auf das Protein abgestimmten und neu etablierten Methoden zur Qualitätskontrolle ermöglichten die Produktion des ETA Rezeptors in routinemäßigen Mengen von etwa 2 Milligramm pro Millilitern Reaktionsansatz. Grundlegende Prozessparameter ergaben sich durch Qualitätsanalysen von ETA Proben nach deren Synthese in verschiedenen zellfreien Expressionsmodi. Die Qualität des Rezeptors war nach Produktion im Präzipitat erzeugenden P CF Modus mit anschließender post-translationeller Solubilisierung deutlich besser im Vergleich zur Synthese mit direkter ko-translationeller Solubilisierung im D CF Modus nach Zugabe von Detergenzien in den Reaktionsansatz. Dieses zunächst überraschende Ergebnis wurde durch Gelfiltrations¬experimente bestätigt. In Übereinstimmung offenbarten Festkörper-Kernmagnetische Resonanz Analysen zudem alpha-helikale Sekundärstrukturelemente in den P-CF generierten ETA Präzipitaten. Als weiteres effektives Mittel zur Modulation der mizellaren Umgebung von P CF synthetisiertem ETA wurde der Detergenzaustausch nach Immobilisierung durch Metallchelat-Affinitätschromatographie verwendet. Als äußerst geeignet wurde Brij 35 identifiziert. ETA zeigte hier in analytischer Größenausschlusschromatographie schlanke Elutionsprofile, in deren Fraktionen das Protein einen hohen Grad an Homogenität im Verbund mit Stabilität aufwies. Negativfärbung belegte die Monodispersität der Proben, die sich außerdem durch eine hohe thermische Sekundärstrukturstabilität auszeichneten. Analysen durch native und denaturierende Gelelektrophorese deuteten auf die potentielle Bildung SDS-resistenter Dimere/Oligomere des ETA Rezeptors hin. Diese Annahme wurde durch Massenspektrometrie unterstützt. Vielwinkel-Lichtstreuung zeigte außerdem, dass Gleichgewichte zwischen monomerem und dimerem ETA Rezeptor offenbar durch das umgebende Mizellenmillieu gesteuert werden können. Zudem wurden erste Hinweise auf das Oligomerisierungs-Potential von zellfrei exprimiertem ETA und ETB durch Ko-Expression und anschließenden Komplexanalysen unter Einbezug hergestellter, fragmentierter Derivate erlangt. Die Ligandenbindungs-Kompetenz des solubilisierten Rezeptors wurde durch Affinitätschromatographie und Fluoreszenz-Anisotropie untersucht. Dieser Ansatz führte zu einem effizienten Protokoll für die Reinigung Liganden-gebundener Rezeptorfraktionen für z.B. Kristallisationsanalysen. Nach Synthese in den identifizierten optimalen Bedingungen im P-CF Modus und Detergenzaustausch in Brij 35 wurden Bindungseffizienzen von bis zu 50 % erzielt, die unter optimalen Bedingungen eine Ausbeute an funktionellem Rezeptor von 0.5 mg/mL zellfreiem Reaktionsansatz ergeben. Übereinstimmende Nachweise der funktionellen Faltung des synthetisierten ETA Rezeptors in Abhängigkeit der Expressionsbedingungen wurden erhalten durch Fluoreszenz-Anisotropie, elektronenmikroskopische Gefrierbruchanalysen von rekonstituierten Proben sowie durch Radioliganden-Experimente zur Bestimmung der Gleichgewichtsdissoziations-konstanten (KD) und der inhibitorischen Konzentrationen (IC50) des natürlichen Liganden Endothelin 1. Die Arbeit bietet eine grundlegende Richtlinie zur Qualitätsoptimierung zellfrei synthetisierter Membranproteine und sie stellt zudem ein Orientierungshilfe zur Prozessentwicklung individueller Expressionsprotokolle dar. Die präparative Produktion hochwertiger Proben an ETA Rezeptor resultierte in der Durchführung umfassender Kristallisationsanalysen als Basis für nachfolgende Arbeiten zur Strukturbestimmung.

Download full text files

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author:Friederike Alessandra Junge
URN:urn:nbn:de:hebis:30-92916
Referee:Volker DötschORCiDGND
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2011/03/04
Year of first Publication:2010
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2011/02/28
Release Date:2011/03/04
Tag:Endothelin-Rezeptor; Proteinexpression; Radioliganden; zellfrei
cell-free; endothelin receptor; functional; protein expression; radioligand
GND Keyword:Endothelin; G-Protein gekoppelte Rezeptoren; Heterologe Genexpression
HeBIS-PPN:234301112
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht