Novel approaches of molecular targeting in Philadelphia chromosome positive leukemia

Neue Ansätze des molekularen Targetings bei der Philadelphia-Chromosom-positiven Leukämie

In Philadelphia Chromosome (Ph) positive ALL and CML the fusion between BCR and ABL leads to the BCR/ABL fusion proteins, which induces the leukemic phenotype because of the constitutive activation of multiple signaling 
In Philadelphia Chromosome (Ph) positive ALL and CML the fusion between BCR and ABL leads to the BCR/ABL fusion proteins, which induces the leukemic phenotype because of the constitutive activation of multiple signaling pathways down-stream to the aberrant BCR/ABL fusion tyrosine kinase. Targeted inhibition of BCR/ABL by ABL-kinase inhibitors induces apoptosis in BCR/ABL transformed cells and leads to complete remission in Ph positive leukemia patients. However, a large portion of patients with advanced Ph+ leukemia relapse and acquire resistance. Kinase domain (KD) mutations interfering with inhibitor binding represent the major mechanism of acquired resistance in patients with Ph+ leukemia. Tetramerization of BCR/ABL through the N-terminal coiled-coil region (CC) of BCR is essential for the ABL-kinase activation. Targeting the CC-domain forces BCR/ABL into a monomeric conformation, reduces its kinase activity and increases the sensitivity for Imatinib. Here we show that i.) targeting the tetramerization by a peptide representing the Helix-2 of the CC efficiently reduced the autophosphorylation of both WT BCR/ABL and its mutants; ii.) Helix-2 inhibited the transformation potential of BCR/ABL independently of the presence of mutations; iii.) Helix-2 efficiently cooperated with Imatinib as revealed by their effects on the transformation potential and the factor-independence related to BCR/ABL with the exception of mutant T315I. These findings suggest that BCR/ABL harboring the T315I mutation have a transformation potential which is at least partially independent from its kinase activity. Targeted inhibition of BCR/ABL by small molecule inhibitors reverses the transformation potential of BCR/ABL. We definitively proved that targeting the tetramerization of BCR/ABL mediated by the N-terminal coiled-coil domain (CC) using competitive peptides, representing the Helix-2 of the CC, represents a valid therapeutic approach for treating Ph+ leukemia. To further develop competitive peptides for targeting BCR/ABL, we created a membrane permeable Helix-2 peptide (MPH-2) by fusing the Helix-2 peptide with a peptide transduction tag. In this study, we report that the MPH-2: (i) interacted with BCR/ABL in vivo; (ii) efficiently inhibited the autophosphorylation of BCR/ABL; (iii) suppressed the growth and viability of Ph+ leukemic cells; and (iv) was efficiently transduced into mononuclear cells (MNC) in an in vivo mouse model. The T315I mutation confers resistance against all actually approved ABL-kinase inhibitors and competitive peptides. It seems not only to decrease affinity for kinase inhibitors but to confer additional features to the leukemogenic potential of BCR/ABL. To determine the role of T315I in resistance to the inhibition of oligomerization and in the leukemogenic potential of BCR/ABL, we investigated its influence on loss-of-function mutants with regard to the capacity to mediate factor-independence. Thus we studied the effects of T315I on BCR/ABL mutants lacking functional domains in the BCR portion indispensable for the oncogenic activity of BCR/ABL such as the N-terminal coiled coil (CC), the tyrosine phosphorylation site Y177 and the serine/threonine kinase domain (ST), as well as on the ABL portion of BCR/ABL (#ABL-T315I) with or without the inhibitory SH3 (delta SH3-ABL) domain. Here we report that i.) T315I restored the capacity to mediate factor independence of oligomerization_deficient p185BCR/ABL; ii.) resistance of p185-T315I against inhibition of the oligomerization depends on the phosphorylation at Y177; iii.) autophosphorylation at Y177 is not affected by the oligomerization inhibition, but phosphorylation at Y177 of endogenous BCR parallels the effects of T315I; iv.) the effects of T315I are associated with an intact ABL_kinase activity; v.) the presence of T315I is associated with an increased ABL_kinase activity also in mutants unable to induce Y177 phosphorylation of endogenous BCR; vi.) there is no direct relationship between the ABL-kinase activity and the capacity to mediate factor_independence induced by T315I as revealed by the #ABL-T315I mutant, which was unable to induce Y177 phosphorylation of BCR only in the presence of the SH3 domain. In contrast to its physiological counterpart c-ABL, the BCR/ABL kinase is constitutively activated, inducing the leukemic phenotype. The N-terminus of c-ABL (Cap region) contributes to the regulation of its kinase function. It is myristoylated, and the myristate residue binds to a hydrophobic pocket in the kinase domain known as the myristoyl binding pocket in a process called “capping”, which results in an auto-inhibited conformation. Because the cap region is replaced by the N-terminus of BCR, BCR/ABL “escapes” this auto-inhibition. Allosteric inhibition by myristate “mimics”, such as GNF-2, is able to inhibit unmutated BCR/ABL, but not the BCR/ABL that harbors the “gatekeeper” mutation T315I. Here we investigated the possibility of increasing the efficacy of allosteric inhibition by blocking BCR/ABL oligomerization. We demonstrate that inhibition of oligomerization was able not only to increase the efficacy of GNF-2 on unmutated BCR/ABL, but also to overcome the resistance of BCR/ABL-T315I to allosteric inhibition. These results strongly suggest that the response to allosteric inhibition by GNF-2 is inversely related to the degree of oligomerization of BCR/ABL. Taken together these data suggest that the inhibition of tetramerization inhibits BCR/ABL-mediated transformation and can contribute to overcome Imatinib-resistance. The study provides the first evidence that an efficient peptide transduction system facilitates the employ-ment of competitive peptides to target the oligomerization interface of BCR/ABL in vivo. Further the data show that T315I confers additional leukemogenic activity to BCR/ABL, which might explain the clinical behavior of patients with BCR/ABL -T315I-positive blasts. In summary, our observations establish a new approach for the molecular targeting of BCR/ABL and its resistant mutants represented by the combination of oligomerization and allosteric inhibitors.
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In der Philadelphia Chromosome (Ph) positiven ALL und CML hat die Fusion von BCR und ABL die Bildung eines BCR/ABL Fusionsprotein zur Folge. Dieses Fusionsprotein ist für den leukämischen Phänotypen aufgrund der konstitu
In der Philadelphia Chromosome (Ph) positiven ALL und CML hat die Fusion von BCR und ABL die Bildung eines BCR/ABL Fusionsprotein zur Folge. Dieses Fusionsprotein ist für den leukämischen Phänotypen aufgrund der konstitutiven Aktivierung vieler Signalwege unterhalb/Downstream der veränderten BCR/ABL fusionierten Tyrosinkinase.Eine zielgerichtete Inhibierung von BCR/ABL mittels ABL-Kinase-Inhibitoren induziert Apoptose in BCR/ABL transformierten Zellen und hat eine komplette Remission in Ph+ Leukämie Patienten zur Folge. Eine große Anzahl an Patienten mit fortgeschrittener Ph+ Leukämie erleiden einen Rückfall und entwickeln Resistenzen. Die Mutation der Kinasedomäne verhindert die Bindung von Inhibitoren und stellt somit den häufigsten Mechanimus von erworbenen Resistenzen in Patienten mit Ph+ Leukämie. Die Tetramerizierung von BCR/ABL mittels der N-Terminalen coiled-coil region (CC) von BCR ist notwendig für die Aktivierung der ABl-Kinase. Das Targeting der CC-Domäne zwingt BCR/ABL in eine monomere Konformation, was zu einer Reduzierung der Kinasaktivität und einer erhöhten Imatinib-Sensitivität führt. Wir können zeigen, daß i) das Angreifen der Tetramerisierung mittels einem Peptide, welches die Helix2 der CC-Domäne repräsentiert, reduziert die Autophosphorylierung sowohl von WT BCR/ABL, als auch seinen Mutanten. ii) Die Helix-2 inhibiert unabhängig von vorkommenden Mutationen das transformierende Potential von BCR/ABL. iii) Aufgrund der Effekte auf das transformierende Potential und dem Faktor unabhängigen Wachstum von BCR/ABL, mit Ausnahme der T315I-Mutation, konnte eine effektive Kooperation zwischen Helix-2 und Imatinib gezeigt werden. Die gezielte Hemmung von BCR/ABL durch Inhibitoren in Form kleiner Moleküle macht das Potential zur Transformation von BCR/ABL rückgängig. Wir haben eindeutig bewiesen, dass das Zielen auf die, durch die N-terminale coiled-coil Domäne (CC) vermittelte, Tetramerisierung von BCR/ABL mithilfe kompetitiver Peptide, welche die Helix-2 von CC repräsentieren, ein wirkungsvoller therapeutischer Ansatz zur Behandlung der Ph+Leukämie ist. Um die kompetitiven Peptide zum Angriff auf BCR/ABL weiter zu entwickeln, erzeugten wir eine Membran permeables Helix-2 Peptid (MPH-2), indem wir die Helix-2 Peptide mit einem Peptid-Transduktions-Tag fusionierten. In dieser Studie berichten wir, dass MPH-2: (i) mit BCR/ABL in vivo interagierte; (ii) effizient die Autophosphorylierung von BCR/ABL hemmte; (iii) Wachstum und Viabilität von Ph+ leukämischen Zellen unterdrückte; und (iv) in einem in vivo Maus-Modell effizient in mononukleäre Zellen (MNC) transduziert wurde. Die T315I Mutation von BCR/ABL weist eine Resistenz gegen alle momentan sich in medizinischen Studien befindlichen ABL-kinase Inhibitoren und kompetitiven Peptiden auf. Es scheint nicht nur die Bindungsaffinität der Kinase Inhibitoren zu vermindern sondern erzeugt zusätzliche Eigenschaften, die das leukämogene Potential von BCR/ABL verstärken. Um die Rolle der T315I Mutation auf dessen fehlender Inhibition der für das leukämogene Potential wichtigen Oligomerisierung von BCR/ABL näher zu bestimmen, untersuchten wir seinen Einfluß auf zusätzliche “loss-of-function” Mutanten von BCR/ABL in bezug auf deren Fähigkeit eine Faktor-Unabhängigkeit zu erzeugen. Entsprechend erzeugten wir BCR/ABL Mutanten, denen notwendige funktionale Domänen bezüglich des onkogenen Potenzials fehlen. Im BCR-Anteil deletierten wir die N-terminale coiled coil (CC) Domäne, die Tyrosine Phosphorylierungs Stelle Y177 und die Serine/Threonine Kinase Domäne (ST) sowie im ABL_Anteil die inhibitorische SH3 (delta SH3-ABL) Domäne. Aus den vorliegenden Arbeiten ergaben sich folgende Ergebnisse i.) T315I stellt die fehlende Faktor Unabhängigkeit von hämatopoetischen Zellen mit Oligomerizations defizienten p185BCR/ABL Mutanten wieder her; ii.) Die Resistenz von p185-T315I gegen die Inhibition der Oligomerisation ist abhängig von der Phosphorylierung am Y177; iii.) Die Autophosphorylierung am Y177 wird durch die Inhibition der Oligomerisierung nicht beeinträchtigt, jedoch die Phosphorylierung am Y177 von endogenem BCR wird durch die T315I Mutation verstärkt; iv.) Die Effekte von T315I sind mit einer intakten ABL_Kinase Aktivität assoziiert; v.) Das Vorhandensein der T315I Mutation ist assoziiert mit einer verstärkten ABL_kinase Aktivität, welches sich auch in Mutanten zeigt, die die Y177 Phosphorylierung von endogenem BCR nicht induzieren; vi.) Es gibt keinen direkten Zusammenhang zwischen der ABL-Kinase Aktivität und der durch T315I induzierten Faktorunabhängigkeit. Im Gegensatz zu der ABL-T315I Mutante, die nur in der Anwesenheit der SH3 Domäne nicht in der Lage war eine Phosphorylierung am Y177 von endogenem BCR zu induzieren. Im Gegensatz zu seinem physiologischen Pendant c-Abl, ist die BCR/ABL Kinase, die den leukämischen Phänotyp induziert, konstitutiv aktiviert. Der N-Terminus von c-ABL (Cap region) wirkt an der Regulation seiner Kinasefunktion mit. Er ist myristoyliert und in einem Prozess, genannt „capping“ bindet der Myristinsäurerest an eine hydrophobe Tasche in der Kinasedomäne, bekannt als Myristinsäurebindungstasche. Daraus resultiert eine autoinhibitorische Konformation. Da die Cap-region durch den N-terminus von BCR/ABL ersetzt wurde, entgeht BCR/ABL dieser Autoinhibition. Allosterische Inhibition durch Myristeinimitatoren, wie GNF-2, sind in der Lage nicht mutiertes BCR/ABL zu inhibieren, nicht jedoch BCR/ABL, das die „Gatekeeper“-Mutation T315I beherbergt. Wir untersuchen hier die Möglichkeit die Effizienz der allosterischen Inhibtion durch Blockierung der BCR/ABL-Oligomerisierung zu erhöhen. Wir demonstrieren, dass die Inhibtion der Oligomerisierung nicht nur in der Lage war die Effizienz von GNF-2 auf das nicht mutierte BCR/ABL zu erhöhen, sondern auch die Resistenz von BCR/ABL-T315I zu überwinden hin zur allosterischen Hemmung. Diese Ergebnisse lassen stark annehmen, dass das Ansprechen der allosterischen Hemmung durch GNF-2 in umgekehrtem Verhältnis zum Grad der Oligomerisierung von BCR/ABL steht. Zusammengenommen deuten diese Daten auf eine Inhibierung der Tetramerizierung hin, welsche die BCR/ABL vermittelte Transformation hemmt. Diese führt zu einer Überwindung der Imatinib Resistenz. Diese Studie bietet erste Evidenz, dass ein effizientes Peptid-Transduktions-System die Anwendung von kompetitiven Peptiden, um auf die Oligomerisierungs-Schnittstelle von BCR/ABL zu zielen, in vivo unterstützt. Des weitern zeigen die Daten, daß T315I zusätzliche leukämische Aktivität von BCR/ABL induziert, welches eine mögliche Erklärung für klinische Prognose von Patienten mit BCR/ABL-T315I positiven Blasten darstellt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Beobachtungen einen neuen Ansatz für molekulare Angriffspunkte für BCR/ABL und seine resistenten Mutanten etablieren, bestehend aus der Kombination von Oligomerisierungs- und allosterischen Inhibitoren.
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Author:Afsar Ali Mian
Referee:Rolf Marschalek
Document Type:Doctoral Thesis
Date of Publication (online):2011/03/15
Year of first Publication:2009
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2010/03/27
Release Date:2011/03/15
HeBIS PPN:232603081
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

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