Biophysical studies on LmrA : a multidrug resistance ABC transporter / von Ute A. Hellmich

LmrA is a member of the ATP Binding Cassette (ABC) transporter family of membrane proteins and a structural and functional homologue of P-glycoprotein1, 2. ABC-transporters share a common architecture of two transmembran
LmrA is a member of the ATP Binding Cassette (ABC) transporter family of membrane proteins and a structural and functional homologue of P-glycoprotein1, 2. ABC-transporters share a common architecture of two transmembrane domains and two nucleotide binding domains. The NBDs are highly conserved in this transporter family whereas the TMDs are highly diverse3. The TMDs recognize the substrate and the NBDs bind and hydrolyze ATP and thus contribute the energy for substrate translocation. ABC transporters as a protein family transport a high number of substrates including peptides, nutrients, ions, bile acids, lipids and other lipophilic compounds. LmrA is a multidrug transporter that recognizes a number of hydrophobic substrates including fluorescent dyes and antibiotics1, 4-6. LmrA is a native protein of the gram-positive bacterium Lactococcus lactis. In this thesis, L. lactis was used as a homologous expression host for the preparation of LmrA for a variety of experiments. Wildtype LmrA as well as a number of cysteine mutants were successfully expressed in L. lactis, purified and subsequently characterized by a variety of biochemical assays (Chapter 4). LmrA can be expressed to very high amounts in L. lactis. The purification and reconstitution were optimized for the requirements of solid-state NMR experiments in this thesis. For the first time, an ABC transporter has been reconstituted in synthetic lipids to a ratio of up to 1:150 (mol/mol). LmrA was shown to be active under magic angle spinning conditions with these reconstitution ratios. By taking advantage of the slower ATP hydrolysis by LmrA ΔK388 (lysine deletion in the Walker A motif), a real-time 31P solid-state NMR ATPase assay was established (Chapter 5). This assay allowed, for the first time, the investigation of all phosphor nuclei during the ATP hydrolysis cycle of a membrane protein simultaneously and in real time7. This assay has been successfully adapted to investigate both ATP hydrolysis and substrate phosphorylation of diacylglycerol kinase (together with S. Wollschlag) and ATP hydrolysis at high temperatures of the thermophilic ABC transporter ABC1 from Thermos thermophilus (together with A. Zutz). In the course of this thesis, the gene for LmrA has been cloned into expression vectors suitable for Escherichia coli and the heterologous expression of LmrA was established (Chapter 4). The functionality of the heterologously expressed protein has been investigated and compared to L. lactis LmrA. In these experiments, LmrA was shown to yield a distinct multidrug resistance phenotype in its E. coli host and to show secondary active multidrug transport in the absence of ATP and presence of a proton gradient [Hellmich et al, in prep] (Chapter 4). Previously, it had been shown that LmrA acts as a seconadary active transporter when the NBDs are truncated8. The overexpression in minimal and defined medium and the purification of LmrA from E. coli have been optimized. Isotope labeling for ssNMR has been established and the first multinuclear ssNMR experiments have been carried out on a functional ABC transporter (Chapter 8). ABC transporters couple two cycles: upon ATP binding, the NBDs dimerize, hydrolyze the ATP, subsequently release Pi and ADP and finally dissociate. During this cycle, conformational changes are relayed to the TMDs which utilize the energy from ATP binding and/or hydrolysis to translocate the respective substrate. The prehydrolysis state can be trapped by beryllium fluoride, whereas the post-hydrolysis state of this cycle can be trapped by vanadate9-12. Trapping protocols for these reagents were successfully established for LmrA in this thesis (Chapter 4). This allowed for the investigation of different catalytic states by both ssNMR and EPR. A general 19F labeling protocol for membrane proteins has been established in the course of this thesis and successfully applied to proteorhodopsin (together with N. Pfleger)13 and LmrA (chapter 6). Single cysteine mutants of LmrA that line out the dimer interface have been labeled with a fluorine label for ssNMR. In the apo state, the 19F labeling indicates highly flexible transmembrane domains, a finding that is supported by 13C ssNMR and EPR measurements. The addition of drugs has a different effect on different positions within the LmrA dimer, therefore indicating that different drugs are recognized at a different position within the protein. For P-glycoprotein and LmrA it has been previously shown by biochemical methods that different drug binding sites co-exist. For a 19F label attached at position 314 (LmrA E314C), the spectra showed two distinct peaks with similar populations. This could hint towards a structural asymmetry within the LmrA dimer that might also be reflected in the alternating ATP hydrolysis at the NBDs. E314 has been specifically implicated with drug transport. Thus, structural asymmetry at this position might be functionally relevant for guiding a substrate through the transporter. Structural asymmetry within a homodimeric ABC transporter has also been shown for BtuCD, the E. coli vitamin B12 importer14. In addition, the conserved glutamates in EmrE, a small multidrug resistance protein, were shown to be asymmetric in the drug bound state15. Both, uniformly 13C/15N labeled as well as selectively amino acid type labeled LmrA has been investigated in different conformational states. Interestingly, significant dynamic changes in the b-sheet regions of LmrA (confined to the NBDs) were observed in the pre-hydrolysis (beryllium fluoride) and transition state (vanadate trapped) state. These were interpreted as the transition from a domain in fast conformational exchange in the apo state to one of intermediate exchange in the nucleotide bound state. A significant change in NBD mobility upon nucleotide binding was previously also shown with 2H ssNMR on LmrA16. By EPR it was shown that LmrA in both the vanadate and BeFx trapped states displays a significantly higher rigidity and therefore defined distances, whereas the apo state resembled a “floppy” protein with no preferred distance distribution. This concurs with data obtained from 19F ssNMR with fluorine labeled single-cysteine mutants. Here, in agreement with the EPR data, a higher label (and possibly) protein mobility was observed in the apo state displaying rather broad line widths. Upon trapping with vanadate, the line widths of the majority of fluorine-labeled mutants decreased due to an enhanced protein rigidity and a more homogenous environment of the fluorine labels. A similar observation was made when increasing the temperature that can be explained due to higher protein flexibility at increased temperatures. Solution NMR was employed to investigate the isolated soluble NBD of LmrA (Chapter 9). First 2D and 3D spectra were successfully obtained and could be utilized for a preliminary assignment of a significant fraction of residues. Additionally, binding of ATP and ADP in absence and presence of magnesium was investigated. Finally, the effects of peptides emulating the coupling helices of the full-length transporter on the soluble NBD were investigated. Strikingly, binding of one of these peptides only occurred in the presence of nucleotides (whereas the other showed no binding at all) hinting towards a tightly coupled regulation of the NBD and TMD during the substrate translocation/ATP hydrolysis cycle based on nucleotide binding.
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LmrA ist ein ATP Binding Cassette (ABC)-Transporter und ein strukturelles und funktionales Homolog von P-glykoprotein. P-glykoprotein erlangte traurige Berühmtheit durch seine Rolle bei der Entwicklung von Resistenzen ge
LmrA ist ein ATP Binding Cassette (ABC)-Transporter und ein strukturelles und funktionales Homolog von P-glykoprotein. P-glykoprotein erlangte traurige Berühmtheit durch seine Rolle bei der Entwicklung von Resistenzen gegen Chemotherapeutika in Tumorzellen. ABCTransporter haben eine gemeinsame Architektur mit zwei Transmembrandomänen (TMD) und zwei Nukleotidbindedomänen (NBD). Während die NBDs dieser Proteinfamilie sehr konserviert sind, unterscheiden sich die TMDs sowohl sequenziell als auch konformationell, obwohl sie immer aus Bündeln von a-Helices gebildet werden. Die TMDs erkennen und transportieren das Substrat, während die NBDs ATP binden und hydrolysieren. Hiermit liefern sie die Energie für den Transportvorgang. Die Proteinfamilie der ABC-Transporter transportiert viele verschiedene Substrate, darunter Peptide, Nährstoffe, Ionen, Gallensäuren, Lipide und lipophile Substanzen. LmrA ist ein Multiwirkstoff-Transporter der eine große Anzahl hydrophober Substrate, darunter Fluoreszentzfarbstoffe und Antibiotika, erkennt. Eine Einführung in Multiwirkstoff-Resistenz und ABC-Transporter im Allgemeinen sowie LmrA im Speziellen findet sich in Kapitel 1. Die verwendeten magnetischen Resonanzmethoden werden in Kapitel 2 erläutert. In Kapitel 3 finden sich die in dieser Arbeit verwendeten Methoden. LmrA ist ein natives Protein aus dem Milchsäurebakterium Lactococcus lactis. In dieser Arbeit wurde L. lactis als homologer Expressionswirt für die Präparation von LmrA für eine Reihe von Experimenten verwendet. Wildtyp LmrA sowie eine Reihe von Cysteinmutanten wurden erfolgreich exprimiert, aufgereinigt und in einer Reihe von biochemischen Assays charakterisiert, wie in Kapitel 4 beschrieben. Im Verlauf dieser Arbeit wurde das Gen für LmrA in geeignete Vektoren für die Expression in Escherichia coli kloniert. Die heterologe Expression wurde daraufhin etabliert. Die Funktionalität des heterolog exprimierten Proteins wurde untersucht und mit aus L. lactis stammenden LmrA verglichen. In diesen biochemischen Experimenten wurde gezeigt, dass LmrA einen distinkten Multiwirkstoffresistenz-Phänotyp in seinem Wirt E. coli hervorruft. Zusätzlich kann LmrA als sekundär aktiver Transporter in Abwesenheit von ATP und Anwesenheit eines Protonengradienten fungieren. In vorhergehenden Studien mit einer verkürzten LmrA Variante, der die NBDs fehlen (LmrA-MD), sowie mit einer Mutante, die nur noch verlangsamt ATP hydrolysiert (LmrA ΔK388) wurde gezeigt, dass LmrA prinzipiell als sekundär aktiver Transporter arbeiten kann. In der hier vorliegenden Arbeit wurde dieser Befund unterstützt und das Prinzip auf den vollständigen Transporter (in Anwesenheit der NBDs) ausgeweitet. LmrA ist damit der einzige ABC-Transporter, für den sekundäre Transporteigenschaften bestätigt wurden. Auch die biochemische Charakterisierung von LmrA aus E. coli ist in Kapitel 4 beschrieben. Die Expression von LmrA in E. coli in Minimal- und definierten Medium wurde in dieser Arbeit für die Festkörper-Nuklearmagnetische Resonanz (NMR) etabliert. Damit ist es nun erstmals möglich, sowohl uniform 13C/15N isotopenmarkierte als auch aminosäurespezifisch markierte Proben von LmrA herzustellen. LmrA kann in sehr großen Mengen bakteriell exprimiert werden. Die Aufreinigung und die Rekonstitution wurden im Rahmen dieser Arbeit optimiert und den Bedingungen von Festkörper-NMR angepasst. Zum ersten Mal konnte ein ABC-Transporter in einem Protein:Lipid Verhältnis von 1:150 (mol:mol) in synthetischen Lipiden rekonstituiert werden. Dies erlaubt die Unterbringung von bis zu 15mg rekonstituiertem Protein im limitierten Volumen von ~70 mL im NMR-Rotor. Mit einem in dieser Arbeit neu entwickelten auf Phosphor-Festkörper-NMR basierendem Echtzeit-ATPase-Experiment konnte gezeigt werden, dass LmrA unter den anspruchsvollen Rekonstitutionsbedingungen seine ATPHydrolyseaktivität beibehält (Kapitel 5). Hierbei wurde die verlangsamte Aktivität einer LmrA ΔK388 Mutante (mit einer Lysindeletion im Walker A motif) ausgenutzt, um die ATPHydrolye von 15mg Protein mit 31P Festkörper-NMR unter Magic Angle Sample Spinning (MAS) in Echtzeit über den Verlauf von Stunden zu verfolgen. Die hier entwickelte Methodik erlaubt es zum ersten Mal, alle chemisch nichtäquivalenten Phosphorkerne vom Substrat ATP und dem Produkt ADP während des ATP-Hydrolysezyklus eines Membranproteins simultan und in Echtzeit zu verfolgen. Dieser Assay wurde desweiteren erfolgreich auf die Untersuchung der ATP-Hydrolyse und Lipidphosphorylierung von Diacylglycerolkinase (in Zusammenarbeit mit S. Wollschlag) und der ATP-Hydrolyse unter erhöhten Temperaturen durch den thermophilen ABC-Transporter ABC1 aus Thermos thermophilus (in Zusammenarbeit mit A. Zutz) ausgeweitet. Hiermit steht nun zum ersten Mal eine Methodik zur Verfügung, die kinetischen Verläufe von Reaktionen in heterogenen Reaktionsräumen (wie der wässrigen und der Lipidphase) in einem einzigen Experiment zu untersuchen. ABC-Transporter verbinden zwei funktionale Zyklen: Nachdem ATP gebunden hat, dimerisieren die NBDs, hydrolysieren das Nukleotid und geben anschliessend das anorganische Phosphat und ADP wieder frei. In einem zweiten, gekoppelten Zyklus werden konformationelle Änderungen, die durch die Bindung und Hydrolyse von ATP and die NBDs hervorgerufen wurden, an die TMDs weitergegeben. Hier wird nun das Substrat, je nach Funktionsweise des Transporters als Ex- oder Importer, aus der Zelle hinaus- oder in sie hineingeschleust. Es ist möglich, die unterschiedlichen Intermediate des Hydrolyse/Transportzyklus zu stabilisieren, so dass sie für längerfristige Untersuchungen zur Verfügung stehen. Der Prähydrolysezustand kann mit dem Phosphatanalog Berilliumfluorid und ATP, der Übergangszustand mit dem Phosphatanalog Vanadat und ATP in situ hervorgerufen werden: Hierzu hydrolysiert der ABC-Transporter ATP und gibt das entstehende anorganische Phosphat frei. An dessen Stelle setzt sich nun das jeweilige Phosphatanalog. Dies bedeutet, dass die Nukleotidbindetasche nun mit dem Phosphatanalog und ADP besetzt ist. In dieser Arbeit wurden erfolgreich Protokolle entwickelt, um LmrA in den oben beschriebenen Intermediaten für Elektronenparamagnetische Resonanz (EPR) und Festkörper-NMR Studien zur Verfügung zu stellen. In Kapitel 6 wird ein in dieser Arbeit entwickeltes generelles Markierungsprotokoll für das Anbringen von Fluorsonden für die 19F Festkörper-NMR an Cysteinresten in Memranproteinen vorgestellt. Dieses wurde erfolgreich auf das Retinalprotein Proteorhodopsin (in Zusammenarbeit mit N. Pfleger) und LmrA angewendet (Kapitel 6). Einfache Cysteinmutanten von LmrA, welche die Monomer-Monomer- Interaktionsfläches des Homodimers auskleiden, wurden erfolgreich mit der Fluorsonde markiert und 19FFestkörper- NMR Spektren aufgenommen. Im Grundzustand zeigt sich, dass LmrA sehr flexible TMDs besitzt. Eine ähnliche Beobachtung wurde durch die aus gepulster EPR erhaltenen Abstandsverteilungen derselben Cysteinmutanten erhalten (Kapitel 7). Auch ist aus den Linienbreiten der 13C Festkörper-NMR Studien eine ähnliche Schlußfolgerung zu ziehen (Kapitel 8). Zusätzlich wurden 19F Festkörper-NMR Untersuchungen an ADP·Vi gebundenen LmrA im Übergangszustand durchgeführt. Diese zeigen, ebenfalls in Übereinstimmung mit den EPR-Studien unter denselben Bedingungen, eine Rigidifizierung des Proteins in der TMD durch die Bindung von Nukleotid in der NBD. Für die 19F-Festkörper-NMR Studien wurden den markierten Proben im Grund- und im Übergangszustand zusätzlich die Fluoreszenzfarbstoffe Hoechst 33342 und Ethidiumbromid hinzugefügt. Diese Farbstoffe werden von LmrA als Substrat erkannt, stimulieren die ATPHydrolyse und werden von LmrA transportiert (Kapitel 4). Interessanterweise zeigten diese Fluoreszenzfarbstoffe nur dann einen Effekt auf das NMR-Spektrum des fluormarkierten Proteins, wenn es sich im Grundzustand befand. Der Übergangszustand wurde nicht beeinflußt. Dies unterstützt die Hypothese, die auch im ATP Switch Model, welches die experimentellen Befunde an diversen ABC-Transportern zu einem allgemeinen Modell über die Funktion von ABC-Transportern zusammenfügt, aufgestellt wurde. In diesem Modell bindet das Substrat an die TMDs des Transporters im Grundzustand. Dies bewirkt eine Konformationsänderung, welche eine Bindung von ATP an die NBDs begünstigt. Nachdem ATP gebunden hat, schliessen sich die NBDs. Dies, und/oder die anschliessende Hydrolyse des Nukleotid verursacht erneut eine Konformationsänderung, welche an die TMDs weitergegen wird und diese veranlasst, das Substrat entgegen der Richtung aus der es band, freizugeben. Zusätzlich hatten die beiden getesten Substrate unterschiedlich starke Effekte auf verschiedene Positionen im Protein. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass unterschiedliche Substrate in unterschiedlichen Regionen des Proteins binden. Für Pglykoprotein und LmrA wurde bereits gezeigt, dass verschiedene Substratbindestellen koexistieren. Für eine 19F-Sonde, welche an Position 314 (LmrA E314C) angebracht wurde, erhält man im Festkörper-NMR Spektrum zwei distinkte Signale mit einer je in etwa gleich großen Population. Eine solche Signalverteilung könnte ein Hinweis auf eine mögliche strukturelle Asymmetrie innerhalb des LmrA-Dimers sein, die auch die alternierende ATP-Hydrolyse in den NBDs erklären würde. E314 wurde bereits spezifisch mit dem Substrattransport in Verbindung gebracht und eine Aminosäure mit einer Carboxylatseitenkette an dieser Stelle ist in einer Reihe von ABC- Multiwirkstofftransportern konserviert. Daher könnte eine strukturelle Asymmetrie an dieser Position funktional relevant für den Substrattransport, möglicherweise auch im Zuge mit einem gleichzeitigen Protonenantiport sein, wie es etwa für die Vertreter der small multidrug resistance (SMR) Proteine postuliert wird. Eine Asymmetrie der konservierten Glutamate im EmrE-Dimer wurde bereits mittels Festkörper-NMR bestätigt. Zusätzlich wurde in der 3D- Struktur des homodimeren Vitamin-B12-ABCTransporter BtuCD auch eine strukturelle Asymmetrie beobachtet. Mit einem ähnlichen Protokoll der Cysteinmodifikation wurden Nitroxidspinlabel an Cysteinreste in LmrA-Mutanten für die Untersuchung mit EPR angebracht. Die Ergebnisse der cw EPR und gepulsten EPR werden in Kapitel 7 vorgestellt. Mit EPR wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass sich die stabilisierten nukleotiodgebundenen Übergangszustände durch eine rigidere TMD und demzufolge durch definierte Abständen zwischen zwei Spinsonden an Cysteinen der beiden Monomere des Homodimers auszeichnen. Im Grundzustand kommt es zu einer breiteren Verteilung der Distanzen zweier solcher Spinsonden und das Protein zeigt ein sehr mobiles Verhalten der TMDs, welche keine präferierte Abstandsverteilung zeigen. Ein solches Verhalten ist in guter Übereinstimmung mit den 19F-Festkörper-NMR Daten. Auch hier wurde eine erhöhte Mobilität des Proteins im Grundzustand (d.h. eine Verteilung auf viele konformationelle Zustände), auf Grundlage der größeren Linienbreiten, festgestellt. Durch die Stabilisierung im Übergangszustand mit ADP·Vi verringert sich die Linienbreite der Mehrheit der Fluorsignale, so dass von einer verringerten Flexibilität des Proteins und einer homogeneren chemischen Umgebung der NMR-Signale der Fluorsonden ausgegangen werden kann. Ein ähnlicher Effekt der Verringerung der Linienbreite wurde auch durch eine Erhöhung der Temperatur erreicht. Hier ist die zugrundeliegende Erklärung die erhöhte Mobilität der Seitenketten und des Proteinrückgrats. In Kapitel 8 dieser Arbeit werden die ersten Festkörper-NMR Spektren eines funktionalen ABC-Transporters vorgestellt. Sowohl das uniform 13C/15N als auch das aminosäurespezifisch isotopenmarkierte LmrA wurden in verschiedenen konformationellen Intermediärzuständen mit Festkörper-NMR untersucht. Interessanterweise wurden substantielle Änderungen der Dynamik in den b-Faltblattregionen von LmrA (welche auf die NBDs begrenzt sind) im Prähydrolyse- (ADP·BeFx) und im Übergangszustand (ADP·Vi) beobachtet. Diese Änderungen wurden als der Übergang einer Proteindomäne in schnellem konformationellen Austausch im Grundzustand zu einem Zustand intermediären Austauschs im Nukleotid gebundenen Zustands interpretiert. Eine signifikante Reduktion der Mobilität der NBD durch Nukleotidbindung wurde bereits in vorhergehenden Studien mit 2H Festkörper-NMR an LmrA gezeigt. Zusätzlich zu den oben beschriebenen EPR und Festkörper-NMR Experimenten am gesamten ABC-Transporter LmrA, wurden auch Lösungs NMR Studien an der isolierten NBD (LmrANBD) durchgeführt (Kapitel 9). Erste heteronukleare 2D und 3D Spektren wurden erfolgreich aufgenommen und eine erste preliminäre Zuordnung der Rückgratsignale (H, N, Ca, Cb, CO) eines signifikanten Anteils aller Aminosäuren konnte erhalten werden. Zusätzlich wurde der Effekt der ATP- und ADP-Bindung in An- und Abwesenheit von Magnesium untersucht. Die Experimente zeigen deutlich, dass sowohl ATP als auch ADP spezifisch an die isolierte NBD binden können und individuelle Effekte, auch in Zusammenhang mit Magnesium, hervorrufen. Schließlich wurden die Bindung und der Einfluss von Peptiden, welche die Kopplungshelices der TMDs emulieren sollen, untersucht. Interessanterweise konnte eines dieser Peptide nur in Anwesenheit von Nukleotiden an die NBD binden, während das andere nicht bindet. Dies deutet auf eine streng regulierte Interaktion der NBD und TMD während des Substrattranslokations-/ATP-Hydrolyse-Zyklus durch Nukleotidbindung hin.
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Author:Ute Hellmich
Referee:Clemens Glaubitz
Document Type:Doctoral Thesis
Date of Publication (online):2011/03/24
Year of first Publication:2010
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2010/05/17
Release Date:2011/03/24
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
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