Biophysical and biochemical characterisation of the SMR proteins Hsmr and EmrE

The increasing resistance of almost all pathogenic bacteria to antibiotics (multidrug resistance) causes a severe threat to public health. The mechanisms underlying multidrug resistance include the induced over expressio
The increasing resistance of almost all pathogenic bacteria to antibiotics (multidrug resistance) causes a severe threat to public health. The mechanisms underlying multidrug resistance include the induced over expression of multidrug transporters which extrude a variety of lipophilic and toxic substrates in an energy dependent fashion through the membrane out of the cell. These proteins are found in all transporter families. The work described in this thesis is dedicated to drug-proton antiporters from the small multidrug resistance (SMR) family. These efflux pumps with just four transmembrane helices per monomer are so far the smallest transporters discovered. Their oligomeric state, topology, three dimensional structure, catalytic cycle and transport mechanism are still rather controversial. Therefore, the aim of this thesis was to directly address these questions for the small multidrug resistance proteins Halobacterium salinarium Hsmr and Escherichia coli (E. coli) EmrE using a number of biophysical methods such as NMR, transport assays, mass spectrometry and analytical ultracentrifugation. Especially the work on Hsmr has been challenging due to the halophilic nature of this protein. In Chapter 1, key questions and the most important biophysical techniques are introduced followed by Material and Methods in Chapter 2. Depending on experimental requirements, cell free or ‘classical’ in vivo expression has been used for this thesis. Cell free expression as an option for the production of small multidrug transporters has been explored in Chapter 3. It has been possible to produce the SMR family members Hsmr, EmrE, TBsmr and YdgF in vitro. The expression of Hsmr was investigated in more detail under different experimental conditions. Hsmr was either refolded from precipitate or maintained in a soluble form during expression in the presence of detergents and liposomes. Furthermore, amino acids for which no auxotrophic strains were available could be labelled successfully. This expression system has been also used for preparing labelled samples of EmrE as described in Chapter 9. In vivo in E. coli expression of Hsmr, as described in Chapter 4, provided large amounts of proteins if fermenter production was used. Uniform labelling and selective unlabelling with stable isotopes (13C, 15N) for NMR spectroscopy was achieved in vivo in a more efficient and cost effective manner than using the cell free approach for this protein. Hsmr could be purified successfully from both in vitro and in vivo expression media. Hsmr is expressed in vivo and in vitro with N-terminal formylation. The Nterminal formylation is unstable and Hsmr in the presence of low salt concentrations was amenable to N-terminal degradation. It was found that Hsmr shows longest stability in Fos-ß-choline® 12 and sodium dodecyl sulphate, but best reconstitution conditions were found, when dodecyl maltoside is used and exchanged with Escherichia coli lipids. A molar protein lipid ratio of 1 to 100, amenable to solid state nuclear magnetic resonance, has been achieved. Sample homogeneity was shown by freeze fracture electron microscopy. The oligomeric state of Hsmr in detergent has been assessed by SDS PAGE, blue native PAGE, size exclusion chromatography, analytical ultracentrifugation and laser induced liquid bead ion desorption mass spectrometry (LILBID) as described in Chapter 5. A concentration and detergent dependent monomer-oligomer equilibrium has been found by all methods. The activity of Hsmr under the sample preparation conditions used here was shown using radioactive and fluorescence binding as well as fluorescence and electrochemical transport assays (Chapter 6). For transport studies, a stable pH gradient was generated by co-reconstitution of Hsmr with bacteriorhodopsin and subsequent sample illumination. Based on the observed long term stability of Hsmr in Fos-ß-choline® 12 and sodium dodecyl sulphate, liquid state NMR experiments were attempted in order to assess the correct folding of Hsmr in detergent micelles (Chapter 7). 1D proton and 2D HSQC spectra of U-15N Hsmr revealed a poor spectral dispersion, low resolution and only a small number of peaks. These are at least partly due to long rotational correlation times of the large protein detergent complex. This problem has been overcome by applying solid-state NMR to Hsmr reconstituted into E. coli lipids (Chapter 8). Uniform 13C labelled samples were prepared and two dimensional proton-driven spin diffusion and double quantum-single quantum correlation spectra were acquired successfully. Unfortunately, the spectral resolution was not yet sufficient for further structural studies. Reasons for the observed linebroadening could be structural heterogeneity or molecular motions which interfere with the NMR timescale. Therefore, the protein mobility has been probed using static 2H solid state NMR on Ala-d3-Hsmr. It could be shown, that parts of Hsmr are remarkably mobile in the membrane and that this mobility can be limited by the addition of the substrate ethidium bromide. Ethidium bromide as well as tetraphenylphosphonium (TPP+) is typical multidrug transporter substrates. The membrane interaction of TPP+ in DMPC membranes has been resolved by 1H MAS NMR. It was found that it penetrates into the interface region of the lipid bilayers and therefore behaves like many other transporter substrates adding to the hypothesis that the membrane could act as a pre-sorting filter. Finally, Chapter 9 is dedicated to the characterisation of the essential and highly conserved residue Glu-14 in EmrE by solid-state NMR. In order to avoid spectral overlap, the single Glu EmrE E25A mutant was chosen instead of the wildtype. The protein has been produced in vitro to take advantage of reduced isotope scrambling in the cell free expression system as verified by analytical NMR spectroscopy. Correct labelling of EmrE was tested by MALDI-TOF and solid-state NMR. The dimeric state of DDM solubilised EmrE has been probed by LILBID. The labelled protein was reconstituted into E. coli lipids to ensure a native membrane environment. Activity was determined by measuring ethidium bromide transport. Freeze fracture EM revealed very homogeneous protein incorporation even after many days of MAS NMR experiments. 2D 13C double quantum filtered experiments were used to obtain chemical shift and lineshape information of Glu-14 in EmrE. Two distinct populations were found with backbone chemical shift differences of 4 - 6 ppm which change upon substrate binding. These findings indicate a structural asymmetry at the assumed dimerisation interface and are discussed in the context of a model for shared substrate/proton binding. These studies represent the first successful use of cell free expression to prepare labelled membrane proteins for solid-state NMR and allow for the first time an NMR insight into the binding pocket of a multidrug efflux pump.
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Die zu beobachtende Antibiotikaresistenz nahezu aller pathogener Bakterien (Multidrugresistenz) stellt ein ernstes medizinisches Problem dar. Einer der molekularen Mechanismen basiert auf der induzierten Überexpression v
Die zu beobachtende Antibiotikaresistenz nahezu aller pathogener Bakterien (Multidrugresistenz) stellt ein ernstes medizinisches Problem dar. Einer der molekularen Mechanismen basiert auf der induzierten Überexpression von Multidrugtransportern, welche eine Vielfalt lipophiler und toxischer Substanzen unter Energieverbrauch durch die Membran aus der Zelle pumpen. Derartige Proteine lassen sich in fast allen Transporterfamilien finden. Diese Dissertation widmet sich Substrat-Protonen-Antiportern der Small Multidrug Resistance (SMR) Familie, welche mit nur 4 transmembranen Helices zu den kleinsten bisher bekannten Transportern gehören. Ihr Oligomerisierungsgrad, 3D Struktur und die molekularen Details des Transportzyklus sind trotz intensiver Studien stark umstritten. Das Ziel dieser Dissertation war es daher zu versuchen, diese Fragen für die Proteine Hsmr, aus Haslobacterium salinarium, und EmrE, aus Escherichia coli (E. coli), mittels biophysikalischer Techniken wie Fluoreszenzspektroskopie, Massenspektrometrie, NMR und analytischer Ultrazentrifugation zu beantworten. Neben den allgemeinen zu erwartenden Problemen bei der Präparation von Membranproteinen stellte der halophile Charakter von Hsmr eine besondere Herausforderung dar. In Kapitel 1 werden die behandelten Proteine, die zu lösenden Fragstellungen und die wichtigsten Methoden eingeführt. Die benutzten Materialien und Methoden sind im Detail in Kapitel 2 beschreiben. Je nach experimentellen Erfordernissen wurde zellfreie Synthese oder „klassische“ in vivo Expression in E. coli für die in dieser Dissertation beschriebenen Arbeiten benutzt. Die Möglichkeiten der zellfreien Synthese als Option für die Herstellung von SMR Proteinen werden in Kapitel 3 untersucht. Es war möglich Hsmr, EmrE, TBsmr und YdgF in vitro in nachweisbaren Mengen zu produzieren. Die Expression von Hsmr wurde im Detail unter verschiedenen experimentellen Bedingungen studiert. Hsmr wurde entweder aus prezipitierter Form rückgefaltet oder direkt in der Gegenwart von Detergenzmizellen oder Liposomen exprimiert. Ein besonderer Vorteil zellfreien Synthese besteht gerade in der Möglichkeit bestimmte Aminosäuren mit stabilen Isotopen zu markieren für die keine auxotrophen Stämme für die in vivo Expression zur Verfügung stehen. Dieser Ansatz wurde für die Herstellung selektiv markierter EmrE Proben verfolgt, wie in Kapitel 9 beschreiben. Durch in vivo Expression von Hsmr in E. coli (Kapitel 4) konnten unter Verwendung eines Fermenters größere Proteinmengen bereitgestellt werden. Verschiedene U-13C und 15N Markierungsschemata konnten in vivo auf eine effizientere und kostengünstigere Art als mit der zellfreien Synthese verwirklicht werden. Hsmr konnte sowohl nach in vitro und in vivo Expression erfolgreich aufgereinigt werden. Hsmr wurde in beiden Fällen mit einer N-terminalen Formylierung exprimiert. Diese N-terminale Formylierung ist instabil. Bei niedriger Salzkonzentration war eine N-terminale Degradation des Proteins zu beobachten. Die Detergenzien die die größte Langzeitstabilität von Hsmr ermöglichen sind Fos-ß-choline® 12 und SDS. Die für die Rekonstituierung besten Bedingungen wurden aber für Dodecylmaltosid und E. coli Lipide gefunden. Es war so ein molares Lipid-Proteinverhältnis von 100:1 möglich, was weitergehende Festkörper-NMR Experimente erlaubt. Eine hohe Probenhomogenität wurde mittels Gefrierbruchelekronenmikroskopie nachgewiesen. Der Oligomerisierungsgrad von Hsmr in Detergenzmizellen wurde mittels SDS PAGE, blau-nativer PAGE, Gelfiltration, analytischer Ultrazentrifugation und Laser induzierter Tröpfchen-Desorptions-Massenspektrometrie (LILBID), wie in Kapitel 5 beschrieben, untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das Gleichgewicht zwischen Monomeren und Oligomeren von der Proteinkonzentration, Salz und Detergenz abhängt. Die Aktivität von Hsmr für die hier etablierten Präparationsbedingungen wurde über Substratbindung (Fluoreszenz, radioaktiv) und mittels Substrattransportmessungen (elektrochemisch, Fluoreszenz) nachgewiesen (Kapitel 6). Das für den Transmembranen Transport notwendige, zeitlich stabile elektrochemische Potential konnte dabei durch Ko-Rekonstituierung von Hsmr mit Bakteriorhodopsin über Probenbeleuchtung erzeugt werden. Da Hsmr in Fos-ß-choline® 12 und SDS längere Zeit stabil war, wurden Lösungs-NMR Experiment an 15N markierten Proben durchgeführt, um die korrekte Faltung des Proteins in Mizellen zu verifizieren (Kapitel 7). Leider konnten aber in 1H- 15N HSQC Spektren nur wenige Resonanzen aufgelöst werden, was vermutlich zum Teil auf die lange Rotationskorrelationszeit dieses Proteindetergenzkomplexes zurückzuführen ist. Dieses Problem konnte jedoch teilweise durch die Anwendung von Festkörper-NMR auf Hsmr in E. coli Lipiden gelöst werden (Chapter 8). Es wurden eine Reihe von zweidimensionalen protonengetriebenen Spindiffusionsexperimenten sowie Doppel- Einzelquanten-Korrelationspektren an vollständig 13C markierten Proben aufgenommen. Leider war die spektrale Auflösung für weiterführende Studien nicht gut genug. Gründe für die zu beobachtende Linienverbreiterung könnten strukturelle Heterogenität oder mit der NMR Zeitskala interferierende molekulare Bewegungen sein. Daher wurde die Proteinbeweglichkeit qualitativ mit statischer 2H NMR an Ala-d3-Hsmr studiert. Es wurde dabei tatsächlich eine hohe molekular Beweglichkeit in Teilen des Proteins beobachtet, die jedoch nach Zugabe des Substrats Ethidiumbromid stark eingeschränkt wurde. Die Lokalisierung des Substrats TPP+ in einer DMPC Membran wurde mittels 1H MAS NMR untersucht. Wie viele andere Substrate auch, lagert sich TPP+ in der Membran oberhalb der hydrophoben Kettenregion ein, was die Hypothese einer membranunterstützten Bindung an das Protein unterstützt. Kapitel 9 widmet sich der Festkörper-NMR Charakterisierung des in der gesamten SMR Familie hochkonservierten Restes Glu14 in Helix 1 am Beispiel von EmrE. Zur Vereinfachung der Spektren wurde die Glu-Mutante EmrE E25A statt des Wildtyps ausgewählt. Um den metabolischen Abbau von U-13C-Glu zu verhindern, wurde das Protein in vitro hergestellt. Markierungseffizienz und korrekter Einbau wurde mittels MALDI-TOF und NMR verifiziert. Um eine möglichst native Situation zu emulieren, wurde das markierte Protein in E.coli Lipide rekonstituiert. Proteinaktivität wurde über Ethidiumbromidtransport nachgewiesen. Mittels Gefrierbruchelektronenmikroskopie konnte ein sehr homogener Einbau des Proteins sogar nach mehreren Tagen MAS NMR Experimenten gesehen werden. 13C chemische Verschiebungen für Glu14 wurden mittels Doppel-Einzelquanten-Korrelationspektren bestimmt. Es konnten zwei Populationen unterschieden werden, die für den Bereich des Proteinrückgrats chemische Verschiebungsdifferenzen von 4–6ppm aufweisen. Nahezu alle Resonanzen ändern sich nach Zugabe von Ethidiumbromid. Diese Beobachtungen weisen auf eine strukturelle Asymmetrie im Bereich des vermuteten Dimerisierungsinterfaces hin und werden im Kontext eines Modells für eine gemeinsame Substrat/Protonenbindungsstelle diskutiert. Diese Studie repräsentiert die erfolgreiche Anwendung der zellfreien Expression zur Herstellung markierter Membranproteine für die Festkörper-NMR. Diese Messungen ermöglichen erstmals einen Einblick in die Bindungstasche einen Multidrugtransporters.
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Metadaten
Author:Ines Lehner
URN:urn:nbn:de:hebis:30-100508
Referee:Clemens Glaubitz
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2011/04/26
Year of first Publication:2008
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2010/12/08
Release Date:2011/04/26
Note:
Gegenüber der Originalausgabe um den Lebenslauf gekürzte Fassung.
HeBIS PPN:24592731X
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

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