Untersuchungen zur Toxizität und Langzeitexpression eines retroviralen Vektors zur Gentherapie der HIV-Infektion

Die Ausbreitung von HIV stellt ein kontinuierlich wachsendes Problem dar [132]. Durch Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) konnte die Morbidität und Mortalität der HIV-Infektion deutlich gesenkt w
Die Ausbreitung von HIV stellt ein kontinuierlich wachsendes Problem dar [132]. Durch Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) konnte die Morbidität und Mortalität der HIV-Infektion deutlich gesenkt werden, jedoch limitieren Resistenzbildungen des Virus und Toxizität der Medikamente den Erfolg. Eine mögliche Therapiealternative bietet die HIV-Gentherapie. Hierbei werden Zellen eines Patienten genetisch modifiziert, so dass sie ein antivirales Genprodukt exprimieren. In der Arbeitsgruppe von Laer (Georg-Speyer-Haus, Frankfurt) wurde der retrovirale Vektor M87o entwickelt, der das antivirale, membranverankerte Peptid maC46 kodiert. Dieses hemmt als Fusionsinhibitor effizient den Viruseintritt von HIV. Als Zielzellen einer HIV-Gentherapie können neben TLymphozyten, den eigentlichen Zielzellen von HIV, auch deren Vorläufer, die hämatopoetischen Stammzellen, verwendet werden. Durch Generierung der gesamten Hämatopoese sollte dies zur Expression des antiviralen Transgens in allen Blutzelllinien führen. Besonders wichtig hierbei ist, dass die Funktion der hämatopoetischen Stammzellen durch die genetische Modifikation möglichst nicht gestört wird. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, toxische Effekte von M87o auf die Repopulierungsfähigkeit hämatopoetischer Stammzellen auszuschließen. Neben den Toxizitätsanalysen sollte auch die Langzeitexpression des retroviralen Vektors nach Transplantation genetisch modifizierter T- und Stammzellen untersucht werden. Eine stabile Expression des Transgens ist vor allem in T-Lymphozyten als Hauptzielzellen von HIV ausschlaggebend für den Erfolg der Gentherapie. Daher war ein weiteres Ziel dieser Arbeit, die Transgenexpression in vivo besonders in T-Lymphozyten im Verlauf zu untersuchen. Hierzu wurden in einem syngenen Mausmodell hämatopoetische Stammzellen mit dem retroviralen Vektor M87o transduziert und in bestrahlte Rag1-defiziente Mäuse transplantiert. Damit mögliche toxische Effekte von M87o auf die Hämatopoese nicht durch den Anteil untransduzierter Zellen im Transplantat maskiert werden, wurde in einer Versuchgruppe der Anteil transduzierter Stammzellen durch MACS-Sortierung auf über 95% angehoben. bAls Kontrollgruppen wurden untransduzierte, aber gleichermaßen kultivierte Stammzellen sowie mit dem Kontrollvektor M87c transduzierte Stammzellen transplantiert. Im folgenden Beobachtungszeitraum von 18-20 Wochen wurde regelmäßig das periphere Blut der Empfängertiere analysiert sowie nach Tötung der Tiere die einzelnen Zellpopulationen der hämatopoetischen Organe Blut, Lymphknoten und Milz charakterisiert. Hierbei konnte keine Toxizität durch M87o nachgewiesen werden. Zwar wurde für M87o-angereicherte Stammzelltransplantate eine verminderte bzw. verzögerte Lymphozytenrepopulierung beobachtet, dies war jedoch wahrscheinlich auf eine eingeschränkte „Fitness“ der Stammzellen durch den Sortierungsprozess und eine geringere Zellzahl im Transplantat zurückzuführen. M87o-transduzierte Stammzellen waren schließlich in der Lage, die komplette Lymphopoese zu generieren. Im Blut, Lymphknoten und Milz der Rezipienten konnten NK-, T- und B-Zellen nachgewiesen werden. Die lymphatische Differenzierung wurde also durch M87o nicht beeinträchtigt. Eine Aussage über die Toxizität von M87o auf die Myelopoese konnte leider nicht getroffen werden. Nach subletaler Bestrahlung der Empfängertiere und damit nur teilweisen Ablation des endogenen Knochenmarks wurden die meisten Zellen der myeloischen Linie durch die Wirts-Stammzellen generiert. Es müssen somit hinsichtlich der Unbedenklichkeit von M87o noch weitere präklinische Untersuchungen erfolgen, bei denen durch letale Bestrahlung der Empfängertiere lediglich die durch Spenderzellen differenzierte Myelopoese analysiert werden kann. Bei den Untersuchungen zur Transgenexpression nach Transplantation genetisch modifizierter Stammzellen konnte eine Langzeitexpression des maC46-Peptids auf allen lymphatischen Zelllinien (T-, B- und NK-Zellen) nachgewiesen werden. Dies zeigt also, dass eine stabile und effiziente Integration des Transgens und somit eine langfristige Expression in vivo möglich ist. Im Verlauf konnten jedoch bei nahezu allen Tieren fallende Anteile M87o-exprimierender Lymphozyten nachgewiesen werden. Dieser beobachtete Expressionsverlust war variabel hinsichtlich des zeitlichen Auftretens sowie zelltypabhängig. Die höchsten Anteile M87o-exprimierender Zellen zeigten sich innerhalb der B-Lymphozyten. Im Rahmen der M87o-Expressionsanalyse nach Transplantation genetisch modifizierter T-Lymphozyten wurden T-Lymphozyten mit unterschiedlicher Transduktionseffizienz in Rag1-defiziente Mäuse transplantiert. Unterschiede in der Langzeitexpression in Abhängigkeit von der ins Genom integrierten Kopienzahl des Vektors konnten hierbei nicht eindeutig gezeigt werden. Bei einigen Tieren konnte eine relativ langfristige in vivo Expression des maC46-Peptids nachgewiesen werden, bei anderen hingegen nachlassende Transgenexpressionen. Insgesamt war die Aussagekraft hier jedoch durch eine nach Transplantation auftretende schwere Kolitis bei den Versuchstieren und somit limitierte Beobachtungszeit stark eingeschränkt.
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The spread of HIV remains a big problem [132]. The introduction of the highly active antiretroviral therapy (HAART) reduced morbidity and mortality drastically, but viral resistance and drug toxicity still limit the succ
The spread of HIV remains a big problem [132]. The introduction of the highly active antiretroviral therapy (HAART) reduced morbidity and mortality drastically, but viral resistance and drug toxicity still limit the success of the therapy. Gene therapy for HIV infection is a possible alternative. In this approach cells from a patient are genetically modified to express an antiviral gene product. The gammaretroviral vector M87o, which encodes the antiviral membrane anchores peptide maC46, has been developed in the group von Laer (Georg-Speyer-Haus, Frankfurt). The maC46 peptide is a fusion inhibitor and blocks very efficient the entry of HIV into target cells. Besides mature T cells, which are one of the major target cells of HIV, also their progenitors, hematopoietic stem cells, could be used as potential target cells of a HIV gene therapy. The generation of the complete hematopoiesis should lead to expression of the antiviral transgene in every blood cell line. But it is very important, that modification of the hematopoietic stem cell should not alter the functionality of these cells. The aim of this thesis was to exclude toxicity of M87o in terms of the repopulation capacity of hematopoietic stem cells. A second question was the long term expression of the maC46 peptide after transplantation of genetically modified T cells or hematopoietic stem cells. As a stable expression of the transgene in the target cells of HIV is a crutial step for success of a HIV gene therapy, expression of the maC46 peptide was analyzed in T cells in vivo over time. For this purpose a syngenic mouse model was used. Hematopoietic stem cells were isolated from wild type mice and were transduced with the retroviral vector M87o. Transduced cells were transplanted into Rag-1 knockout mice. As for this experiment moderate transduction efficiency was used, toxicity of M87o might be covered by the nontransduced cells. Therefore in a second experiment transduced cells were MACS sorted prior to transplantation. The amount of gene modified cells was increased with this strategy to over 95%. To groups of mice were set up in parallel as negative controls, the first were transplanted with Mock transduced cells and the second one with M87c transduced cells. Mice were followed up for 18-20 weeks after transplantation. Peripheral blood and after sacrifice additionally lymphoid organs (spleen and lymph nodes) were analyzed for transgene expression in different lymphoid cell types. In summary no toxic effects of M87o on hematopoesis could be observed. Animals that recived M87o transduced and MACS-sorted cells showed a delayed repopulation with lymphocytes, but this is most likely due to an impaired fitness of stem cells after MACS-sorting and low numbers of transplanted cells. At day of sacrifice all animals were completely repopulated with donor cells and showed a broad spectrum of lymphocytes (B, T and NK cells) in all analyzed organs. Thus the lymphatic differentiation was not affected by M87o. For the mouse model, which has been used during this thesis, it is difficult to draw a conclusion for toxicity of M87o on myelopoesis. As the recipients are only sublethally irradiated, most myeloid cells originated again from remaining recipient cells. Further studies in a mouse model with lethal irradiation have to be done to exclude toxicity of M87o on myelopose. In these experiments expression of M87o was detected in all lymphatic cells (B, T and NK cells) until the day of sacrifice. It was shown that there was a stable and efficient integration of the transgene and a long term expression in vivo. But over time also a partial loss of expression was observed. This varied for the time point of downregulation as well as the degree between different cell types. The most stable expression was seen in B cells. In a second experiment mature T cells were isolated and transduced with M87o. Cells were transduced with different amounts of virus, which resulted in different copy numbers of integrated transgene. These cells were also transplanted into Rag-1 knockout mice and gene expression was analyzed over time. In these experiments no clear correlation between copy number of the transgene and expression was seen. Some animals showed long term expression of the maC46 peptide, in others a loss of expression was seen. But this T cell transplantation model was limited as the animals developed a severe colitis, so that time for follow up was reduced.
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Metadaten
Author:Elena Sauter
URN:urn:nbn:de:hebis:30-103094
Referee:Dorothee von Laer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2011/05/10
Year of first Publication:2010
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2011/02/11
Release Date:2011/05/10
Note:
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden. 
Institutes:Medizin
Dewey Decimal Classification:610 Medizin und Gesundheit
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License LogoArchivex. zur Lesesaalplatznutzung § 52b UrhG

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