Solid-state NMR investigations of the ATP binding cassette multidrug transporter LmrA

The development of resistance to multiple drugs is a major problem in treatment of number of infectious diseases and cancer. The phenomenon of multidrug resistance (MDR) is based on the synergetic interplay of a number o
The development of resistance to multiple drugs is a major problem in treatment of number of infectious diseases and cancer. The phenomenon of multidrug resistance (MDR) is based on the synergetic interplay of a number of mechanisms such as target inactivation, target alteration, prevention of drug influx as well as active extrusion of drugs from the cell. The latter is mediated by over-expression of multidrug efflux pumps. The first discovered and the best characterized until now the human MDR transporter is P-glycoprotein. It is a member of the ATP binding cassette (ABC) superfamily and acts as an active transporter for a variety of anticancer agents using the energy released by ATP hydrolysis. The closest structure and functional homologue of P-glycoprotein found in bacteria is LmrA from Lactococcus lactis. The major goals of this work are to establish the selective isotope labelling of LmrA in Lactococcus lactis, to optimize LmrA sample preparation for solid-state NMR, and finally to perform first solidstate NMR investigations on LmrA shedding light on its catalytic cycle and substrate binding. For a long time the solid-state NMR applications to biological science has been limited to investigation of small molecules mostly. Recently, the solid-state NMR methods have shown potential for structuraland non-perturbing, site directed functional studies of large membrane proteins as well as ligands bound to them. However, to our knowledge neither selective isotope amino acid labelling of any ABC transporter, nor NMR investigations on full-length ABC transporter have been reported to date. Solidstate NMR experiments on a membrane protein require reconstitution of purified proteins into a membrane environment at a high density and either isotopic enrichment of the protein or bound drugs or inhibitors. Therefore, the large quantities of LmrA reconstituted at a high density in lipid membranes, sufficient for advanced NMR studies have been produced and its functional state in reconstituted form has been assessed. In the next step, a procedure for cost effective selective amino acids isotope labelling of LmrA in Lactococcus lactis has been established. Using this protocol deuterium alanine labelled LmrA reconstituted into E. coli liposomes has been prepared. Deuterium NMR has been used extensively to assess the proteins dynamics in past. However, it has never been applied to ABC transporter. Here, we report 2H NMR on selective alanine isotope labelled LmrA which has been used to shed light on the dynamics changes in the protein occurred under AMP-PNP, non-hydrolysable ATP analogue, binding and in ATP/ADP-Vanadate trapped state. It has been found that the major conformation changes affecting the protein motional characteristics occur in the ATP binding domains but not in the transmembrane domains. Additionally, the binding of several substrates to LmrA has been studied by fluorescence spectroscopy as well as by 19F and 31P solid-state NMR. The binding constants for several LmrA substrates have been obtained by fitting the concentration dependant tryptophan intrinsic fluorescence quenching curves. Based on the fluorescence studies and solid-state NMR data, the conformation changes in LmrA under substrate binding have been discussed. In addition, the preferable location of nine LmrA and P-glycoprotein substrates within the model membrane has been studied via 1H-MAS-NOESY-NMR. The results have been interpreted with respect to LmrA and P-glycoprotein binding site accessibility from the membrane interface region.
show moreshow less
Die Entstehung von Resistenzen gegenüber mehrerer Wirkstoffe ist ein großes Problem bei der Behandlung einiger ansteckender Krankheiten und Krebs. Multiwirkstoff Resistenzen (MDR) basieren auf einem synergetischen Zusamm
Die Entstehung von Resistenzen gegenüber mehrerer Wirkstoffe ist ein großes Problem bei der Behandlung einiger ansteckender Krankheiten und Krebs. Multiwirkstoff Resistenzen (MDR) basieren auf einem synergetischen Zusammenspiel mehrerer Mechanismen wie der Inaktivierung oder Veränderung des Angriffziels, Verhinderung des Wirkstoffeinstroms ebenso wie der aktive Transport von Wirkstoffen aus der Zelle heraus. Der letzere wird durch die Überexpression von Multidrug Effluxpumpe vermittelt. Der erst entdeckte und am besten charakterisierte ist der menschliche MDR Transporter P-Glycoprotein. Er gehört zur Superfamilie der ATP Bindekassetten (ABC) und wirkt als aktiver Transporter für mehrere Anti-Krebs Stoffe. Die Energie wird durch ATP Hydrolyse gewonnen. Die ähnlichste Struktur und funktionelles Homolog von P-Glykoprotein, das in Bakterien gefunden wurde, ist LmrA von Lactococcus lactis. Das Hauptziel dieser Arbeit ist es, LmrA in Lactococcus lactis aminosäureselektiv mit Isotopen zu markieren, die Probenpräperation für Festkörper NMR zu optimieren und letztendlich erste Festkörper NMR Untersuchungen an LmrA durchzuführen, um den katalytischen Zyklus und die Substrat-Bindung aufzuklären. Seit längerer Zeit waren die Anwendungen der Festkörper NMR im Bereich der Biologie meist auf die Untersuchung kleiner Moleküle beschränkt. Kürzlich haben die Methoden der Festkörper NMR Potential für strukturelle und nicht-störende ortsspezifische funktionale Studien großer Membranproteine sowie ihrer Liganden gezeigt. Es gibt bis jetzt jedoch nach unserem Wissen weder amonosäureselektive Isotopen-Markierung von ABC Transportern, noch NMR Untersuchungen an einem gesamten ABC Transporter. Festkörper NMR Experimente an einem Membranprotein erfordern die Rekonstitution mit einer hohen Konzentration und entweder Anreicherung von Isotopen des Proteins oder gebundener Wirkstoffe oder Inhibitoren. Deshalb wurden große Mengen von LmrA mit einer hohen Konzentration in Lipidmembranen für Festkörper-NMR rekonstituiert. Im nächsten Schritt wurde ein Verfahren für effiziente selektive Markierung von Aminosäuren von LmrA in Lactococcus lactis etabliert. Unter Verwendung dieses Protokolles wurde LmrA, das mit deuteriertem Alanin markiert war und in E. coli Liposomen rekonstituiert war, hergestellt. Deuterium NMR wurde in der Vergangenheit umfangreich genutzt um die Dynamik der Proteine zu untersuchen. Sie wurde jedoch niemals auf ABC Transporter angewendet. Hier werden 2H NMR experimente an Alanin-Isotopen markiertem LmrA vorgestellt, um die Veränderungen der Dynamik in dem Protein bei Bindung von AMP-PNP, einem nicht hydrolysierbares ATP Analogon, und in einem im ATP/ ADP-Vandat eingefangenen Zustand zu zeigen. Es stellte sich heraus, dass die wichtigsten Konformationsänderungen, die die Bewegung des Proteins beeinflussen, in der ATP-Binde-Domäne auftreten, nicht aber in den Transmembran-Domänen. Zusätzlich wurde die Bindung mehrerer Substrate an LmrA mit Fluoreszenz Spektroskopie untersucht als auch mit 19F und 31P Festkörper NMR. Die Bindungs-Konstanten für mehrere LmrA Substrate wurden mittels Tryptophan Fluoreszenz–Quenching erhalten. Bezogen auf die Fluoreszenz-Untersuchungen und Festkörper NMR Daten wurden die Konformations-Änderungen von LmrA bei der Substrat Bindung diskutiert. Zusatzlich wurde die bevorzugte Lokalisierung von neun Substraten von LmrA und P-Glykoprotein innerhalb der Modell-Membran durch 1H-MAS-NOESY-NMR untersucht. Die Ergebnisse wurden in Bezug auf die Zugänglichkeit der Bindungs-Stelle in LmrA und P-Glykoprotein von der Membranzwischenschicht interpretiert.
show moreshow less

Download full text files

Export metadata

  • Export Bibtex
  • Export RIS

Additional Services

    Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author:Alena Siarheyeva
URN:urn:nbn:de:hebis:30-31890
Referee:Clemens Glaubitz
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2006/10/05
Year of first Publication:2006
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2006/09/04
Release Date:2006/10/05
HeBIS PPN:181518147
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

$Rev: 11761 $