Open Access

Kerstin Schmöe

• Employing NMR spectroscopy, it is not only possible to calculate the three dimensional structures of single proteins, but also to study dynamics and conformational changes of protein-complexes. In fact that is an important aspect, since the protein function depends on dynamics and interactions with other molecules. Therefore the study of protein-protein interactions is of highest importance for a better understanding of biological processes. Based on NMR methods, in this thesis we were able to determine protein-protein interactions within the enterobacterial Rcs signalling complex which is regulated via a phosphorelay. Originally identified as regulator of capsule synthesis, the Rcs phosphorelay is now considered to be implicated in stress response caused by disturbances in the peptidoglycan layer. Beyond that the Rcs system is involved in multiplex transcriptional networks including cell division, motility, biofilm formation and virulence. Because of such global nature and its extraordinary structural organisation involving membrane integrated sensor proteins (RcsC, RcsD), coactivators (RcsF, RcsA) and a transcription factor (RcsB), the Rcs system is one of the most remarkable phosphorelays in the family of enterobacteriacaea. During the complex phosphotransfer the histidine phosphotransferase (HPt) domain of the intermediary RcsD protein mediates the phosphotransfer between RcsC and RcsB, and probably modulates the phosphorylation state of the response regulator RcsB. Therefore the present work has been focused on the interface between RcsD and RcsB in more detail. In the first part of the thesis a new domain within the RcsD protein has been identified and structurally analysed by liquid NMR spectroscopy. RcsD is an inner membrane bound hybrid sensor like-kinase composed of a periplasmic sensor domain and a cytoplasmic portion. The cytoplasmic part contains the histidine like-kinase (HK) domain and the histidine phosphotransferase (HPt) domain. By analysis of the secondary structure in more detail, it was shown here that the two domains are intermitted by an additional 13.3 kDa domain. Corresponding to the position of the ABL (α−β−loop) domain of RcsC, located C-terminal to the RcsC-HK domain, the new identified domain was named RcsD-ABL. The central structural element of RcsD-ABL is a β-sheet composed of six strands with a β1−β2−β3−β4−β6−β5 topology and surrounded by two α-helices α1 and α2. In the second part of the thesis, RcsD-ABL is identified as a binding domain for the response regulator RcsB by NMR titration experiments. Such a binding domain for a response regulator has so far only been described for the histidine kinase CheA. In reportergene assays with β-galactosidase and ONPG as substrate it was shown that overexpression of RcsD-ABL in high amounts inhibited binding of RcsB to its target promoter. The β-galactosidase activity was reduced by 80 % with respect to cells carrying no plasmid encoding RcsD-ABL. The mapping of the binding interface was successfully achieved by chemical shift perturbations, a fast mapping protocol and selective labelling. It was shown that the interaction between RcsD-ABL and RcsB takes place via a binding interface comprising mainly the two α-helices of RcsD-ABL and the α-helices α7, α8 and α10 in the effector domain of RcsB. In the third part of the thesis, the interaction of RcsB with RcsD-ABL was related to that with RcsD-HPt. Using NMR titration experiments and ITC measurements, a comparison of the binding constants (Kd) of RcsB interacting either with the isolated RcsD-ABL (2 PM) or the isolated RcsDHPt domain (40 PM) revealed a higher affinity of RcsD-ABL to RcsB. A conjugate of RcsD-ABL-HPt interacting with RcsB decreased the Kd in the one-site fitting mode to 10 PM. However, the two-site fitting mode applied for RcsD-ABL-HPt/RcsB interaction resulted in a Kd (RcsD-ABL) of 2 PM and a Kd (RcsD-HPt) of 8 PM, indicating that RcsD-ABL enhances the binding of RcsD-HPt to RcsB. In the last part of the thesis, it was partly possible together with the data obtained from NMR titration experiments, PRE measurements and a HADDOCK protocol to develop a geometrical model for the interaction of RcsD with RcsB. In this model the receiver domain of RcsB interacts with the RcsD-HPt domain and the RcsB effector domain interacts with the RcsD-ABL domain. These results lead to surprising insights on the regulation of phosphorelays, since normally the effector domain binds to DNA. Here the effector domain is recognized by the newly identified RcsD-ABL domain. Prospectively, further investigations of phosphorylation affects and mutational studies will be of great interest.
• Über 2,5 Milliarden Jahre hat es gedauert bis die Kommunikationswege sich soweit entwickelt hatten, dass aus Einzellern mehrzellige Lebewesen entstehen konnten. Besonders für einzellige Organismen ist die Übermittelung von Signalen geradezu überlebenswichtig, um so vor Schäden aus der Umwelt bewahrt zu werden. Die Komplexität der daran beteiligten Regulationssysteme ist im Gegensatz zur unbelebten Natur enorm. Die Erforschung der Mechanismen und Dynamiken dieses großen Proteinnetzwerkes wird deshalb von Wissenschaftlern mit aktivem Interesse vorangetrieben. Ein wichtiger Punkt bei der Erforschung dieser oft noch unverstandenen Prozesse ist das Verständnis auf strukturbiologischer Ebene, denn dies beinhaltet nicht nur ein Verstehen grundlegender biologischer Prozesse, sondern auch die Basis der gezielten Entwicklung von neuen antibakteriellen Agentien. Mit Hilfe der NMR Spektroskopie wird es ermöglicht nicht nur die Struktur der Proteine, sondern auch deren Dynamik und Konformation zu untersuchen. Dies ist in der Tat ein wichtiger Aspekt, da die Proteinfunktion von Dynamik und Interaktion mit anderen Molekülen abhängt. Das Studium von Protein-Protein-Wechselwirkungen, insbesondere der spezifischen Erkennungs- und Kopplungsmechanismen, ist deshalb von zentraler Wichtigkeit und wurde im Rahmen dieser Arbeit mittels NMR spektroskopischer Methoden am enterobakteriellen Rcs Signaltransduktionssystem untersucht. Ursprünglich als Regulator der Kapselsynthese (Regulator of capsule synthesis) entdeckt, gilt das Rcs System zurzeit als Sensor von Stress, der durch Störungen in der Peptidoglycanschicht verursacht wird. Darüber hinaus ist es jedoch auch über ein multiples Regulationsnetztwerk in Zellteilung, Motilität, Biofilmbildung und Virulenz involviert. Wegen dieses globalen Charakters und seiner außerordentlich strukturellen Organisation bestehend aus membranständigen Sensorproteinen (RcsC, RcsD) und Koaktivatoren (RcsF, RcsA) sowie dem Transkriptionsfaktor RcsB, zählt das Rcs System zu den bemerkenswertesten Phosphorylierungskaskaden in Enterobakterien. Während des Phosphotransfers dient die Histidin Phosphotransferase (HPt) Domäne des Intermediatproteins RcsD vermutlich als Schnittstelle bei der Modulierung des Phosphorylierungszustandes vom Antwortregulator RcsB. Obwohl das Rcs System auf mikrobiologischer Ebene gut charakterisiert ist, ist die strukturelle Organisation des Rcs Systems weitgehend unbekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb eine detaillierte strukturelle und funktionelle Beschreibung der bedeutenden RcsD/RcsB Schnittstelle in Escherichia coli. Im ersten Teil dieser Arbeit stand die Identifizierung und Struktur einer neuen Domäne im RcsD Protein. Im Detail ist RcsD ein in der Innenmembran verankertes Sensorprotein bestehend aus einer periplasmatischen Sensordomäne und einem cytosolischen Teil. Der cytosolische Teil setzt sich aus einer Pseudo-Histidinkinase (HK) Domäne und einer Histidin Phosphotransferase (HPt) Domäne zusammen. Beide Domänen sind durch einen langen Linker miteinander verbunden. In dieser Arbeit konnte jedoch aufgrund einer genauen Analyse von Strukturvorhersagen im Linkerbereich eine neue Domäne identifiziert werden, die sich C-terminal zur Pseudo-Histidinkinase (HK) Domäne von RcsD befindet und damit einen großen Teil des Linkers ersetzt. Entsprechend zu einer ähnlichen Position, C-terminal zur HK Domäne im RcsC Protein, an der sich die RcsC-ABL (α-β-Loop) Domäne befindet, wurde die neue Domäne als RcsD-ABL bezeichnet. Das 13,3 kDa große Protein wurde in Escherichia coli bei 37°C in löslicher Form exprimiert und die dreidimensionale Struktur mittels NMR Spektroskopie gelöst. Die mit einer RMSD von 0.58 Å für die Rückgratprotonen (N, Cα, C) und einer RMSD von 0.97 Å für alle schweren Atome erhaltene Struktur weist als zentrales Element ein sechs strängiges β- Faltblatt mit einer β1-β2-β3-β4-β6-β5 Topologie auf, wobei β5 antiparallel orientiert ist, und welches von zwei α-Helices flankiert wird. Nach einer DALI - Suche wurde die Struktur der neuen Domäne der CheY Superfamilie zugeordnet. Im zweiten Teil der Arbeit wurde versucht die neue Domäne in den funktionellen Zusammenhang einzuordnen. Zunächst wurde die Interaktion von RcsD-ABL mit anderen funktionell wichtigen Domänen der Rcs Phosphorylierungskaskade untersucht. Dazu wurden 1H-15N - TROSY - HSQC Spektren von 15N markierten RcsD-ABL aufgenommen und RcsD-ABL jeweils mit der Phosphorylierungsdomäne („Phosphoreceiver“, PR) von RcsC (RcsC-PR), der ABL Domäne von RcsC (RcsC-ABL) und der HPt Domäne von RcsD (RcsD-HPt) titriert. Die Experimente zeigten, dass RcsD-ABL weder mit RcsC-PR noch mit RcsD-HPt wechselwirkte. Da die meisten Hybridsensorkinasen erst durch Homodimerisierung aktiv werden, aus genetischen Studien aber keine Dimerisierung von RcsC selbst nachgewiesen werden konnte, existiert die Hypothese, dass RcsC möglicherweise direkt eine heterodimere Einheit mit RcsD bilden könnte. Diese Idee konnte jedoch bisher nicht untermauert werden. In diesem Projekt bestand deshalb die Vermutung, dass eine solche Dimerisierung womöglich durch eine Interaktion von RcsD-ABL und RcsC-ABL vermittelt wird. Eine Wechselwirkung von RcsD-ABL und RcsC-ABL konnte durch die hier durchgeführten Untersuchungen jedoch nicht demonstriert werden. Stattdessen wechselwirkt die neue Domäne RcsD-ABL mit dem Transkriptionsfaktor RcsB. RcsB zählt zu den Transkriptionsfaktoren, die homolog zur LuxR Familie sind, und setzt sich aus einer N-terminalen Phosphorylierungsdomäne und einer C-terminalen DNA-Bindungsdomäne mit einem HTH (helix-turn-helix) Motiv zusammen. Das Phosphorylierungsmotiv in RcsB bildet sich aus drei Aspartatresten an den Positionen 10, 11 und 56. Die Phsophorylierung findet an der Position 56 statt. Dass eine Histidinkinase eine Bindungsposition für einen Antwortregulator besitzt, war bisher nur für die Histidinkinase CheA, zentrale Komponente in der bakteriellen Chemotaxis, bekannt. In zweiten Teil dieser Arbeit ist es gelungen einen zweiten Fall einer Bindungsdomäne für einen Antwortregulator zu identifizieren. Auf Grund dessen war es Gegenstand und Ziel des zweiten Projektes die Interaktionsfläche dieses neuen Proteinkomplexes RcsD-ABL:RcsB möglichst genau zu beschreiben. Zur Charakterisierung der Interaktionsfläche von RcsD-ABL im Komplex mit RcsB wurden die Resonanzen bzw. Aminosäuren, die in der NMR Titration mit RcsB eine Veränderung in der chemischen Verschiebung zeigten, auf der Proteinoberfläche von RcsD-ABL gekennzeichnet. Danach sind die α-Helicen αI und αII an der Interaktion mit RcsB beteiligt. Darüber hinaus zeigten sich auch besonders im N-terminus und im β-Strang β3 signifikante Differenzen in der chemischen Verschiebung einiger Resonanzen (Aminosäuren Gln712- Leu713, Asn715-Gly717, Thr719, I734-Thr737, Gly747, Gln776-Val779). Umgekehrt wurde die Interaktionsfläche von RcsB im Komplex mit RcsDABL untersucht. Als problematisch stellte sich hier jedoch die vollständige strukturelle Analyse des Bindungspartners RcsB dar. Dabei traten folgende Probleme auf: Zum einen ließ sich RcsB nur zu einer Proteinkonzentrationen von 200 PM einkonzentrieren. Diese Konzentration ist im Allgemeinen für 3D NMR Experimente (z.B. HNCACB, NOESY) zu niedrig. Zum anderen waren Kristallisationsexperimente erfolglos, wie aus früheren Arbeiten bekannt war. Vermutlich aufgrund der dynamischen Struktur von RcsB. Desweiteren konnte in die der Arbeit zwar ein hochaufgelöstes 1H-15N -TROSY-HSQC, das 90 % der zu erwartenden Resonanzen für RcsB zeigte, erhalten werden, jedoch nur unter hohen Salzkonzentrationen (30 mM Bis-TRIS, 250 mM NaCl, 100 mM MgSO4, pH 6.1). Eine hohe Salzkonzentration erniedrigt jedoch wiederum die Sensitivität für die Kryo-NMR-Sonde. Aus diesen Gründen konnten schließlich nur 60 % der Resonanzen, hauptsächlich die der C-terminalen Effektordomäne, durch NMR Spektroskopie zugeordnet werden. Aufgrund dieser unvollständigen Zuordnung des Proteinrückgrats wurde das Problem in dieser Arbeit durch das Erstellen eines Homologiemodels von Escherichia coli RcsB gelöst. Dies wurde erreicht indem die bekannte Struktur der Effektordomäne von Erwinia amylovora RcsB mit dem homologen Transkriptionsfaktor NarL und der Aminosäuresequenz von Escherichia coli RcsB überlagert wurde. Dies in Kombination mit einem fast mapping Protokoll (Expression in DL39 Zellen, die auxotroph für die Aminosäuren Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, Valin und Lysin sind) und HNCO Experimenten von selektiv 15N, 13CO markierten Aminosäurepaaren machte es möglich die Interaktionsfläche von RcsB im Komplex erfolgreich zu beschreiben, ohne das Proteinrückgrat von RcsB vollständig zugeordnet zu haben. An der Interaktion sind danach die α- Helicen α7, α8 und α10 in der Effektordomäne von RcsB beteiligt. Diese Domäne ist auch die DNA Bindungsdomäne von RcsB. Weiterhin konnte die Interaktion von RcsD-ABL und RcsB durch einen β-Galaktosidasetest in vivo bestätigt werden. Dazu wurde angenommen, dass eine Überexpression von RcsD-ABL in DH300 Zellen die Aktivität des Effektors RcsB herabsetzt. Der E. coli Stamm DH300 besitzt den Promoter rprA, dessen Aktivität abhängig von RcsB ist und für die Expression einer kleinen RNA verantwortlich ist. Diesem rprA Promoter wurde ein LacZ Gen nachgeschaltet. Wird der rprA Promotor durch RcsB aktiviert, wird die β- Galactosidase exprimiert. Als Substrat dient in diesem Falle ONPG. Die Aktivität der β-Galaktosidase gibt Aufschluss darüber wieviel RcsB an den Promotor bindet und kann durch den Abbau von ONPG verfolgt werden. Die Aktivierung des Rcs Systems erfolgte über Zugabe des Antibiotikums Meccillinam. Der Wildtyp DH300 zeigte eine neunmal höhere Aktivität als ohne Antibiotikum - Aktivierung. Die Zugabe eines RcsD-ABL kodierenden Plasmids und Induktion mit IPTG führte zu einer Verminderung von 80 % der Aktivität. Die Überexpression von RcsD-ABL in DH300 inhibiert danach die Aktivität von RcsB, was wiederum zu einer verminderten Aktivität des rprA Promoters führt. Im dritten Teil der Arbeit wurde schließlich versucht den Mechanismus der Interaktion zu beleuchten. Zum einen wurde dies durch NMR spektroskopische Methoden, zum anderem durch Isotherme Titrationskalorimetrie versucht. Dazu wurden die Proteine RcsB, RcsD-ABL, RcsD-HPt und das Konjugat RcsD-ABL-HPt exprimiert. Das Protein RcsDHPt wurde von Dr. Vladimir Rogov zur Verfügung gestellt, der die Domäne bereits in früheren Arbeiten exprimiert und strukturell charakterisiert hatte. Die NMR Titrationen von RcsD-ABL und RcsD-HPt mit RcsB zeigten einen schnellen Austausch auf der NMR Zeitskala. Die für das Konjugat RcsDABL- HPt erfolgte Titration mit RcsB dagegen zeigte einen intermediären Austausch. Danach wird die Affinität von RcsB zur HPt Domäne durch die Anwesenheit von RcsD-ABL verstärkt. In vergleichenden ITC Messungen mit dem one-site-fitting-Modus wurde für die Interaktion RcsD-ABL/RcsB ein Kd Wert von 2 PM bestimmt, für RcsD-HPt/RcsB ein Kd Wert von 40 PM. Für das Doppelkonstrukt RcsD-ABL-HPt reduzierte sich der Wert zu 10 PM. Im twosite- fitting-Modus jedoch zeigte sich für das Konjugat RcsD-ABL-HPt für die RcsD-ABL Domäne ein Kd von 2 PM und ein Kd von 8 PM für die RcsD-HPt Domäne. Danach konnte hier gezeigt werden, dass die neu identifizierte Domäne RcsD-ABL die Bindung zu RcsD-HPt verstärkt. Aufgrund der Dynamik der Komplexbildung, der Größe des RcsD-ABLHPt: RcsB Komplexes (ca. 50 kDa) und den physikalischen Eigenschaften von RcsB war es nicht möglich die Struktur des Komplexes mittels NMR Spektroskopie zu lösen. Im vierten Teil der Arbeit wurde deshalb versucht ein Modell des Komplexes mittels eines HADDOCK-Protokolls unter Einbeziehung von CSP1 und PRE2 Daten zu erstellen. Jedoch gelang es nicht den Komplex aus vier Domänen zu modellieren. Es ist aber gelungen ein geometrisches Modell des Komplexes zu entwickeln, mit dessen Hilfe ein möglicher Bindungsmechanismus schematisch erklärt werden konnte. In diesem Model interagiert die N-terminale Domäne von RcsB mit der RcsDHPt Domäne und die C-terminale Effektordomäne von RcsB mit der RcsDABL Domäne. Da bekannt ist, dass Transkriptionsfaktoren ihre Konformation durch Phosphorylierung ändern können, ist die Untersuchung von Konformationswechseln ausgelöst durch Phosphorylierung zukünftig von höchstem Interesse, konnte aber hier aufgrund der Instabilität der Proteine nicht gezeigt werden. Abschließend lassen sich drei wesentliche Punkte, die im Zuge dieser Arbeit erreicht wurden, festhalten: 1. Es wurde eine neue Domäne in der Rcs Phosphorylierungskaskade identifiziert und deren dreidimensionale Struktur mittels NMR Spektroskopie gelöst. Die Domäne wurde nach einer ähnlichen Domäne, RcsC-ABL, in der Phosphorylierungskaskade als RcsD-ABL (α-β-Loop Domäne) bezeichnet. 2. Die neue Domäne RcsD-ABL interagiert im unphosphorylierten Zustand mit der Effektordomäne des Antwortregulators RcsB. Damit wurde eine Art Bindungsdomäne für den Antwortregulator RcsB in der Rcs Phosphorylierungskaskade entdeckt. 3. Die neue Domäne RcsD-ABL zeigt eine höhere Affinität zu RcsB als die RcsD-HPt Domäne und scheint die Bindung von RcsD-HPt zu RcsB zu stabilisieren. 4. Ausblick: Weitere mikrobiologische und biophysikalische Untersuchungen im phosphorylierten Zustand von RcsB sind nötig, um genauere Informationen über die biologische Aktivität von RcsDABL zu erhalten