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Senthil Thyagarajan

• Project I: The progression of rod and cone degeneration in retinally degenerate (rd) mice ultimately results in a complete loss of photoreceptors and blindness. The inner retinal neurons survive and several recent studies using genetically targeted, light activated channels have made these neurons intrinsically light sensitive. We crossbred a transgenic mouse line expressing channelrhodopsin2 (ChR2) under the control of the Thy1 promoter with the Pde6b(rd1) mouse, a model for retinal degeneration (rd1/rd1). Approximately 30-40% of the ganglion cells of the offspring expressed ChR2. Extracellular recordings from ChR2-expressing ganglion cells in degenerated retinas revealed their intrinsic light sensitivity which was approximately 7 log U less sensitive than the scotopic threshold and approximately 2 log U less sensitive than photopic responses of normal mice. All ChR2-expressing ganglion cells were excited at light ON. The visual performance of rd1/rd1 mice and ChR2 rd1/rd1 mice was compared. Behavioral tests showed that both mouse strains had a pupil light reflex and they were able to discriminate light fields from dark fields in the visual water task. Cortical activity maps were recorded with optical imaging. The ChR2rd1/rd1 mice did not show a better visual performance than rd1/rd1 mice. In both strains the residual vision was correlated with the density of cones surviving in the peripheral retina. The expression of ChR2 under the control of the Thy1 promoter in retinal ganglion cells does not rescue vision. Project II: Lentiviral vectors are becoming the vector of choice for transgene delivery into cells due to their ability to infect non- dividing cells and stably integrate the gene into the genome of the host. Two different viral vector systems, namely HIV-1 and SIV and three different viral vectors PLECYT, PHRCMVChR2 of HIV-1 family and PBjChR2 of SIV were used in this study. The efficiency of the vectors was analyzed by applying them onto the retinal explants in culture and checking the transgene expression. The transgene in the PLECYT lentiviral vector was driven by the EF1A promoter. Upon administration of 5.2 X 106 infectious units of PLECYT viral vector suspension onto the retinal explant resulted in the transduction of retinal ganglion cells. Very few other retinal neurons were found transduced. In the case of PHRCMVChR2, approximately 5 X 105 TU/ml of the vector was used and resulted in the transduction of different neuronal subtypes. Many amacrine cells, ganglion cells and Müller cells were found expressing the transgene. For PBjChR2, 5.6 X104 TU/ml was used which resulted in Müller cell- specific transduction. Very few or no other retinal neurons were found transduced. This study demonstrates the transduction efficiency of different viral vectors on the retinal neurons in vitro. An interesting observation on these viral vectors is their altered tropism. The glycoprotein of the virus is critical for determining their tropism and in this study, all the viral vectors generated were pseudotyped with VSVG, which confers a broad non-specific spectrum of infection. However, analyzing the transgene expression, the viral vectors differ from one another and show remarkable difference in their transduction pattern. To list a few factors that might possibly responsible for the drastic transduction difference exerted by the viral vectors include; 1. Promoters used to drive the transgene expression. 2. HIV or SIV component of the vector in combination with the promoter 3. Titre of the vector used and 4. Other factors like pH and serum used in the study. Therefore optimizing the viral vectors and generating high titers would increase the efficiency and cell-type specific expression of the transgene.
• Vererbte Degeneration von Stäbchen und Zapfen, die zu Blindheit führen betreffen etwa einen von 3000 Menschen weltweit. Mäuse, welche die rd1 Retinadegenerationsmutation (rd1/rd1) tragen, verlieren nahezu alle Photorezeptoren und sind somit zum bevorzugten Modell für Studien zur Retinadegeneration und für Versuche, die Photorezeptoren zu erhalten, geworden. Die Mutation betrifft die rod phosphodiesterase (PDE), die an der Weiterleitung visueller Signale beteiligt ist. Neuronen in der Retina reagieren auch auf das Absterben von Photorezeptoren was zu funktionellen und morphologischen Veränderungen führt, allerdings bleiben viele Retinaneuronen und deren synaptische Schaltkreise auch nach Degeneration der Photorezeptoren erhalten. In letzter Zeit gab es einige Studien mit der Zielsetzung, diese überlebenden Retinaneuronen selbst lichtsensitiv zu machen, um damit die Sehfähigkeit nach Photorezeptordegeneration wieder herzustellen: Bi et al. injizierten virale Vektoren (adeno-associated virus, AAV) in den Glaskörper um Retinaneuronen zu transfizieren, welche dann lang anhaltende Expression des mikrobiellen Rhodopsins (channelrhodopsin-2, ChR2) aufwiesen. ChR2 exprimierende Ganglionzellen zeigten intrinsische Lichtsensitivität. Ein vergleichbares Experiment wurde von Tomita et al. in blinden Ratten (RCS, rdy/rdy) durchgeführt. Hierbei konnten nach AAV-vermittelter Transduktion von retinalen Ganglionzellen mit ChR2 im Cortex visuell ausgelöste Potentiale gemessen werden. Lagali et al. exprimierten ChR2 in retinalen ON bipolaren Zellen in rd1/rd1 Mäusen und konnten damit stabile Reaktionen auf Licht in diesen Zellen auslösen. In Verhaltensstudien zeigten rd1/rd1 Mäuse, welche ChR2 in ON Ganglionzellen exprimierten, Reaktionen auf visuelle Stimuli. Lin et al. verwendeten AAV Injektionen in den Glaskörper von rd1/rd1 Mäusen um mauseigenes Melanopsin ektopisch zu exprimieren und konnten anschliessend Lichtreaktionen von 10% der Ganglionzellen messen. Ausserdem zeigten die so behandelten Mäuse Reaktionen auf visuelle Stimulation in Verhaltensexperimenten. Zhang et al. exprimierten ChR2 und Halorhodopsin in retinalen Ganglionzellen und beobachteten ON, OFF und ON-OFF Reaktionen auf Licht. In dieser Studie wurden transgene Mäuse verwendet, welche ein ChR2-YFP (yellow fluorescent protein, gelb fluoreszierendes Protein) Fusionsprotein im ZNS (zentrales Nervensystem) exprimieren. Die Mäuse wurden in einen genetischen rd1/rd1 Background gekreuzt und es wurde die Expression von ChR2-YFP in der Retina untersucht. Ca. 30% der Ganglionzellen exprimierten ChR2-YFP. Dann wurden die Lichtreaktionen der Ganglionzellen von Wildtypmäusen und ChR2 rd1/rd1 verglichen, der zeitliche Verlauf der Degeneration von Zapfen in der Retina von rd1/rd1 Mäusen verfolgt und zentrale visuelle Reaktionen durch Messung von intrinsischen Signalen im visuellen Cortex mithilfe bildgebender Verfahren studiert. Zum Schluss wurden noch die visuellen Fähigkeiten der Mäuse in einem „optischen zwei Möglichkeiten Unterscheidungstest― bei niedrigen Lichtintesitäten am unteren Ende der Sehfähigkeit und bei hohen Lichtintensitäten (>1x1015 Photonen/cm2/s) bestimmt. Das Ziel dieser Studie war, die Möglichkeit zu untersuchen, mithilfe von ChR2 die Sehfähigkeit bei rd1/rd1 Mäusen und letztendlich bei Menschen mit fortschreitender Degeneration von Stäbchen und Zapfen, die zu Erblindung führt, wiederherzustellen. In den oben angeführten Studien wurde ChR2 durch Virustransfer in retinalen Ganglionzellen von rd1/rd1 Mäusen exprimiert und gezeigt, dass optische wiederhergestellt werden können, allerdings waren hierzu extrem hohe Lichtintensitäten notwendig. Durch die Generierung einer transgenen Maus, die ChR2 in 30-40% aller Ganglionzellen exprimiert und durch kreuzen dieser Maus mit der Photorezeptordegenerationsmauslinie rd1/rd1, konnten wir eine homogenere und stärker standardisierte „blinde― Retina züchten, als in Experimenten mit viralem Gentransfer. Wir untersuchten dann die Frage, ob ChR2 in dieser Mauslinie das Sehvermögen bei normalen Tageslichtverhältnissen (100 cd/m2; 2.8 · 1013 Photonen/cm2/s) und bei sehr hoher Lichtintensität (>10,000 cd/m2; >2.8 · 1015 photons/cm2/s) wiederherstellen kann. ....