Die Bedeutung des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1 (HIF-1) in Makrophagen für den Schutz vor oxidativem Stress und die Tumorangiogenese

Hypoxie und Stickstoffmonoxid (NO) sind wichtige Mediatoren von akuten und
chronischen Erkrankungen sowie auch von Tumoren. Makrophagen spielen
eine zentrale Rolle bei der Eliminierung von Pathogenen aber auch bei der
Hypoxie und Stickstoffmonoxid (NO) sind wichtige Mediatoren von akuten und
chronischen Erkrankungen sowie auch von Tumoren. Makrophagen spielen
eine zentrale Rolle bei der Eliminierung von Pathogenen aber auch bei der
Induktion, Entwicklung und Metastasierung von Tumoren. Wenn Makrophagen
in verletztes Gewebe, einen Entzündungsherd oder in einen Tumor einwandern,
sind sie einem Umfeld ausgesetzt, das durch Hypoxie und die Produktion von
NO und ROS erheblichen Stress auf die Zellen ausübt. Dieser Zellstress wirkt
sich auf das Redoxgleichgewicht und damit auf die Signaltransduktion der
Zellen aus.
Im ersten Teil meiner Arbeit wurde mittels einer Micoarray-Analyse die
Interaktion von hypoxischen und NO-vermittelten Signalen in Makrophagen und
deren Bedeutung für die Zellen im entzündlichen Umfeld ermittelt. In RAW
264.7 Makrophagen wurden 196 Gene als Hypoxie-reguliert 85 Gene als
DETA-NO-reguliert identifiziert. Die Mehrzahl der Gene (292) wurde jedoch von
einer Kombination aus Hypoxie und DETA-NO reguliert und lediglich 14 Gene
wurden in allen drei Ansätzen identifiziert. Aus der Gruppe der durch
Hypoxie-und DETA-NO-regulierten Transkripte zeigte Sesn2 als Peroxiredoxin
(Prdx) Reparatur-Protein eine signifikant höhere Induktion durch DETA-NO im
Vergleich zur Hypoxie. Mit Hilfe von HIF-1α-/- Maus-Peritonealmakrophagen
wurde Sesn2 als sowohl Hypoxie- und NO-reguliertes HIF-1α Zielgen identifiziert. Eine Vorinkubation der RAW 264.7 Zellen mit DETA-NO reduzierte
die Bildung von überoxidiertem, inaktivem Prdx durch H2O2. Die Reduktion an
überoxidiertem Prdx durch eine Vorinkubation mit DETA-NO konnte mittels
eines siRNA knockdowns auf Sesn2 zurückgeführt und Sesn2 als
Prdx-Reduktase etabliert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine
Vorinkubation von Makrophagen mit NO die Akkumulation von Sesn2
HIF-1α-abhängig induziert und somit Prdxs vor einer Überoxidierung durch
ROS schützt. Die Aktivierung von HIF-1α durch Hypoxie oder NO kann somit die Vitalität von Zellen in einem entzündlichen Mikroumfeld verbessern.
Im zweiten Teil meiner Arbeit wurde mittels konditioneller knockouts von HIF-2α und HIF-2α in myeloiden Zellen deren Auswirkung auf die Tumorentwicklung im PyMT Tumormodell untersucht. Die Tumorbelastung der Tiere zeigte in Folge der myeloiden knockouts von 1α und HIF-2α nur eine leichte Tendenz zu geringerer Tumorbelastung. Im Gegensatz zum myeloiden HIF-2α knockout
beschleunigte der knockout von HIF-1α die Tumorinzidenz in PyMT Mäusen 
verlangsamte jedoch die Tumorentwicklung. Zusätzlich führte der myeloide
knockout von HIF-1α und HIF-2α zu verstärkter Tumorhypoxie. Dies konnte auf
eine Beeinträchtigung der Tumorangiogenese in den Tumorkernzonen
zurückgeführt werden, wobei die Angiogenese durch das Fehlen von
myeloidem HIF-1α am stärksten beeinträchtigt wurde. Während der Entstehung
eines Tumors und dessen Progression werden die Tumorumgebung, das
sogenannte Stroma, und der Tumor selbst von unterschiedlichen Immunzellen
infiltriert. Der myeloide knockout von HIF-1α hatte erheblichen Einfluss auf die
Immunzellverteilung im Tumorgewebe. Es wanderten weniger Makrophagen
und B Zellen in den Tumor ein, wohingegen die Zahl von CD4+ T Helfer Zellen
signifikant erhöht war. Zusätzlich wurde die Reifung der Dendritischen Zellen
(DCs) durch den myeloiden knockout von HIF-1α erheblich beeinträchtigt. 

Der myeloide knockout von HIF-2α resultierte lediglich in einer verminderten Zahl an B Zellen und T Zellen im Tumorgewebe. Wildtyp und HIF-2α-/- Makrophagen,
die hypoxische Tumorareale infiltrierten wiesen eine erhöhte Akkumulation von
HIF-1α Protein auf. Makrophagen mit einem knockout von HIF-1α zeigten daraus folgend keine Akkumulation des HIF-1α Proteins in hypoxischen Tumorarealen. Darüber hinaus wurde Ym1 in allen Makrophagen-Genotypen im
Tumorgewebe gleichstark exprimiert, wohingegen die Expression von iNOS im
Tumorgewebe durch den myeloiden knockout von HIF-1α und HIF-2α verringert war. Die kolokalisierte Expression von iNOS und Ym1 in den
Tumor-assoziierten Makrophagen deutet auf eine sowohl pro- als auch
anti-inflammatorische Aktivierung der Makrophagen im Tumor hin. Die
Ergebnisse der Immunzellverteilung von Makrophagen, unreifen DCs, CD4+ T
Helfer Zellen sowie auch die verminderte iNOS-Expression weisen jedoch auf
ein eher anti-inflammatorisches Tumormileu der PyMT+/-/HIF-1α -/- Tiere hin.
Dies zeigt, dass HIF-1α in Makrophagen an der Entstehung eines inflammatorischen Tumormileus beteiligt ist.
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Hypoxia and NO are major mediators of acute or chonic diseases as well as of
tumors. Macrophages are crucial for pathogen elimination but also induction,
progression and escape of tumors. They infiltrate wounded tissue
Hypoxia and NO are major mediators of acute or chonic diseases as well as of
tumors. Macrophages are crucial for pathogen elimination but also induction,
progression and escape of tumors. They infiltrate wounded tissue, inflammatory
sites or malignant tumors. This results in their exposure to a hyopoxic
environment including NO and ROS causing extensive cellular stress. Cell
metabolism and redox homeostasis are considerably affected by an
inflammatory microenvironment.
In the first part of this study I investigated via microarray analysis the interaction
of hypoxic and NO signals in macrophages and their impact on cells in an
inflammatory environment. I identified 196 hypoxia-regulated genes in
RAW 264.7 macrophages. 85 genes were regulated by DETA-NO but the
majority of genes (292) were regulated by a combination of hypoxia and
DETA-NO. Only 14 genes were regulated by all treatments. The Prdx repair
protein Sesn2 is a hypoxia- and NO-regulated gene that shows a significant
higher induction of Sesn2 after DETA-NO compared to hypoxia. With HIF-1α-/-
peritoneal mouse macrophages Sesn2 was identified as a hypoxia-and
NO-regulated HIF-α target gene. Preincubation of RAW 264.7 cells with
DETA-NO resulted in reduced H2O2-dependent Prdx overoxidation and
enzymatic inactivation. Experiments with a siRNA knockdown showed that the
reduction of overoxidized Prdx after preincubation with DETA-NO is
Sesn2-dependent. This identifies Sesn2 as a Prdx reductase in this system.
Taken together I propose that a preincubation of macrophages with NO
accumulates Sesn2 in a HIF-1-dependent manner and protects Prdxs against
overoxidation and inactivation by ROS. Activation of HIF-1 by hypoxia or NO
can improve the cell viability in an inflammatory environment through induction
of the Prdx repair protein Sesn2.
In the second part of this study I investigated the role of myeloid HIF-1α and HIF-2α in the tumor development of PyMT mice. The myeloid knockout of HIF-1α and HIF-2α resulted in a slightly reduced tumor burden. In contrast to
the myeloid HIF-2α knockout of HIF-1α accelerated tumor incidence but retarded tumorprogression. Additionaly the myeloid knockout of HIF-1α and HIF-2α caused an increase in tumor hypoxia due to an impairment of tumorangiogenesis in the core zones of the tumors with the myeloid knockout
of HIF-1α showing the most dramatic effect. During tumor initiation  tumor
progression the stroma and the tumor itself are infiltrated by different immune
cells. The myeloid knockout of HIF-1α mainly affected the distribution of
immune cells in the tumor tissue. The numbers of infiltrating macrophages and
B cells were reduced whereas the number of infiltrating CD4+ T helper cells was
significantly increased. Additionally, the maturation of Dendritic Cells (DCs) was
considerably impaired by the myeloid knockout of HIF-1α. The myeloid knockout of HIF-2α only resulted in decreased numbers of B and T cells infiltrating the tumor tissue. 
Wildtype and HIF-2α-/- macrophages accumulated HIF-1α protein when they infiltrated hypoxic tumor areas. HIF-1α-/- macrophages failed to accumulate HIF-1α protein in hypoxic areas as a
consequence of the myeloid HIF-1α knockout. In additon Ym1 was equally expressed in tumors of all genotypes, whereas the myeloid knockout of HIF-1α and HIF-2α resulted in a reduced iNOS expression in tumor-associated
macrophages. The colocalization of iNOS and Ym1 in tumor tissue indicates a
coexistance of pro- and anti-inflammatory macrophages in the tumor
environment. The data of the distribution of macrophages, immature DCs, CD4+
T helper cells as well as the reduced iNOS-expression are indicators for a more
anti-inflammatory tumor environment of the PyMT+/-/HIF-1α-/- mice. This
suggests that HIF-1α in macrophages promotes the progression of an inflammatory tumor environment.
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Metadaten
Author:Silke Essler
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-240968
Referee:Bernhard Brüne, Heiko Mühl
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2012/03/06
Year of first Publication:2011
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2011/12/14
Release Date:2012/03/06
Pagenumber:X, 123
Note:
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS PPN:311946186
Institutes:Medizin
Dewey Decimal Classification:610 Medizin und Gesundheit
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License LogoArchivex. zur Lesesaalplatznutzung § 52b UrhG

$Rev: 11761 $