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Ismail Hassani

• Parvulustat ist ein kleines Protein (8,2 kDA), das aus dem Bodenbakterium Streptomyces parvulus sekretiert wird. Es ist ein saures Polypeptid mit einem isoelektrischen Punkt von 4,49 und inhibiert spezifisch α-Amylasen (Ki = 9 x 10-12). In der vorliegenden Arbeit sollen neben der Isotopenmarkierung des Parvulustats PL-Mutanten mittels PCR-Mutagenese und DNA Rekombinationstechnick hergestellt werden. Zur Charakterisierung und Strukturbestimmung der Mutanten werden größere Mengen des jeweiligen Proteins benötigt, wofür wiederum ein effektives Expressionssystem bereitstehen muß. Ein Expressionssystem besteht aus einem Wirtsorganismus der seinen Protein-Biosynthese- Apparat zur Verfügung stellt und einem Vektor (Plasmid) der das Zielgen trägt. Im Falle des Parvulustats und seiner Mutanten bietet sich der gut charakterisierte Stamm Streptomyces lividans TK 24 (Hopwood et al, 1985) als Wirtsorganismus an. Der Inhibitor wird in ihm als Vorläuferprotein mit Signalpeptid als Transportsignal (Leader) gebildet. Da dieses Bakterium keine äußere Membran besitzt, wird der Inhibitor direkt ins Kulturmedium ausgeschleust. Dabei wird das Signalpeptid durch die Signalpeptidase abgespalten. Das Strukturgen wird zuerst im Klonierungsplasmid pSH09 in E. coli vervielfältigt, bevor es mit den Enzymen EcoRI und SpeI geschnitten wird, um in den Expressionsvektor pSH017 integriert zu werden. Dieser Shuttlevektor trägt genauso die gewünschten Restriktionsschnittstellen, SpeI und EcoRI, die die paßgenaue Ligation des rekombinanten Strukturgens mit den funktionellen Elementen erlauben. Nach erfolgtem Einbau des Zielgens in das neue Vektorkonstrukt kann dieser Expressionsvektor leicht in den Wirtsorganismus eingebracht werden und sich dort vermehren. Nach Klonierung der mutierten Parvulustatsgene in den Expressionsvektor werden die damit transformierten Zellen auf R2YE-Platten aufgebracht und bei einer Temperatur zwischen 20 und 28°C je nach PL-Mutanten inkubiert. Zur Selektion wird Thiostrepton verwendet. Nach Transformation und Vermehrung geeigneter Wirtszellen wird das klonierte Gen transkribiert. Durch anschließende Translation der gebildeten mRNA in der Wirtszelle entsteht das gewünschte Protein in großen Mengen. Zur Überprüfung der Aktivität der einzelnen Mutanten steht der qualitative α-Amylase-Plattentest zur Verfügung, wobei die aktiven Mutanten einen blauen Hemmhof bilden (siehe Abbildung 24). Der blaue Jod-Stärke-Komplex weist, bei gleichzeitigem Vorhandensein von α-Amylase, auf nicht abgebaute Stärke und damit indirekt auf die Produktion des α-Amylase-Inhibitors hin. Da das Parvulustat von den Bakterien ins Medium abgegeben wird, besteht die Abtrennung der Zellen durch Zentrifugation des Kulturmediums. Es folgen Ammoniumsulfatfällung des Überstandes, Auftragung auf PAGE und präparative HPLC, nach der reines, einheitliches Protein isoliert werden konnte.