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Florian Rohrbach

• Tumorspezifische T-Zellen stellen den im Prinzip wirkungsvollsten Mechanismus zur Abstoßung von Tumoren dar. Voraussetzung für die Aktivierung tumorspezifischer zytotoxischer CD8+ T-Zellen (Tc oder CTLs) ist die Präsentation von Tumorantigenen auf MHC-Klasse I Molekülen durch professionelle Antigen-präsentierende Zellen (APCs). Wegen ihrer Schlüsselrolle bei der Aktivierung von T-Zellen werden APCs in der aktiven Krebs-Immuntherapie eingesetzt. Unabhängig von CTLs können auch CD4+ Helfer T-Zellen (Th) eine Reihe effektiver Anti-Tumor Mechanismen einleiten. Die Aktivierung von CD4+ erfordert die Präsentation des Antigens via MHC-Klasse II Molekülen. Bis jetzt konnten jedoch nur einige wenige tumor-spezifische Th-Epitope identifiziert werden, welche auf MHC-Klasse II Molekülen präsentiert werden. Aus diesem Grund benutzen die meisten derzeitigen Vakzinierungsstrategien definierte Tc-Epitope, die in der Lage sind, spezifische Immunantworten gegen das Tumorantigen auszulösen. Diese Vakzine basieren auf tumorspezifischen Peptiden, Proteinen oder Proteinfragmenten, aber auch auf DNA-Konstrukten, welche für ein bestimmtes Tumorantigen kodieren. Um allerdings eine ausreichend starke Immunreaktion auszulösen, ist es notwendig diese normalerweise nur schwach immunogenen Substanzen zusammen mit Adjuvanzien zu verabreichen. Dendritische Zellen (DCs) sind hoch-effiziente APCs. Weil sie in der Lage sind, die primäre Immunantwort einzuleiten werden sie auch als „natürliches Adjuvanz“ bezeichnet. Nicht zuletzt deswegen werden bei der Entwicklung von Vakzinen immer mehr die einzigartigen Eigenschaften von DCs ausgenutzt. Gegenwärtige Studien untersuchen daher die Beladung von DCs mit synthetischen, tumorspezifischen Peptiden oder Tumor-Lysaten, um eine Aufnahme des Tumorantigens sowie dessen anschließende Präsentation auf MHCKlasse I Molekülen zu erreichen. Obgleich einige dieser Vakzinierungs-Ansätze zu vielversprechenden Ergebnissen führten, sind solche Strategien mit der aufwendigen und kostenintensiven ex vivo Aufbereitung primärer Dendritischer Zellen verbunden. Zudem muss gewährleistet sein, dass die ausgewählten T-Zell Epitope auch vom jeweiligen MHC-Haplotyp des Patienten präsentiert werden. Um einige dieser Nachteile auszugleichen, wären „Konstrukte“ wünschenswert, welche in vivo einen zielgerichteten Transport eines oder besser, mehrerer T-Zell Epitope zu den Dendritischen Zellen ermöglicht. Mit der Entwicklung und Optimierung von Systemen, die Tumorantigene gezielt zu und in APCs transportieren, könnte die Effizienz herkömmlicher Vakzinierungen gesteigert und deren Dosierung verringert werden. In dieser Arbeit wird die Herstellung sowie die funktionelle Charakterisierung zweier neuartiger Vakzine beschrieben. Diese Vakzine wurden für die in vivo Vakzinierung gegen das tumorassoziierte Antigen ErbB2 (HER2/neu) entwickelt. ErbB2 wird in einer Reihe von Tumoren wie Brust- und Ovarialkarzinomen oder Adenokarzinomen der Lunge überexprimiert. Andere Tumorenentitäten wie Kolon-, Nieren-, Blasen-, Speicheldrüsen-, Prostata- und Pankreaskarzinome zeigen ebenfalls eine variable Überexpression von ErbB2. Ziel des ersten der beiden Vakzinierungsansätze war eine verbesserte Aufnahme und Präsentation von Tumorantigenen durch APCs zu erreichen. Als Teil eines Fusionsproteins sollte hier die zielgerichtete Bindung einer antigenen Determinante an APC-spezifische Oberflächenmoleküle und deren anschließende Aufnahme und Prozessierung innerhalb von APCs ermöglicht werden. Als mögliche APC-Bindedomäne wurde ein Fragment gewählt, welches sich vom extrazellulären Anteil des B7-Rezeptors CTLA-4 (CTLA-4125) ableitet. B7 ist ein Oberflächenprotein, das speziell auf APCs exprimiert wird. Nach der bakteriellen Expression und Reinigung wurde durch FACS-Analyse gezeigt, dass lösliches humanes CTLA-4125 spezifisch sowohl an murine als auch humane B7 Moleküle bindet und daher als effektive APC-Bindungsdomäne für den zielgerichteten Transport von Tumorantigenen zu APCs verwendet werden kann. Als chimäre Proteinvakzine zur spezifischen Bindung an APCs wurden zwei mit C-ErbB2(N) bzw. C-E-ErbB2(N) bezeichnete Fusionsproteine konstruiert. Diese setzen sich aus CTLA-4125 am N-Terminus für die Bindung an APCs und einem Fragment des extrazellulären Teils des humanen tumorassoziierten ErbB2 Antigens (ErbB2(N), Aminosäuren 1-222) am C-Terminus zusammen. Beim C-E-ErbB2(N) Protein wurde zusätzlich die Translokationsdomäne von Pseudomonas exotoxin A (ETA II) zwischen der APC-Bindungsdomäne und der antigenen Determinante eingefügt. Diese Domäne könnte nach Rezeptor-vermittelter Aufnahme des Fusionsproteins die Freisetzung des Tumorantigens aus dem Endosom ins Zytoplasma verbessern und so die Prozessierung und Präsentation des Antigens via MHC-Klasse I verstärken. Beide chimären CTLA-4-ErbB2 Fusionsproteine wurden in E. coli exprimiert und mittels Metallchelat-Chromatographie aus den bakteriellen Lysaten gereinigt. Die spezifische Bindung der rekombinanten Fusionsproteine an B7 Moleküle auf der Zelloberfläche sowie deren Aufnahme durch B7-exprimierende humane Raji Zellen wurde mittels FACS Analyse und konfokaler Mikroskopie nachgewiesen. In Balb/c Mäusen wurde untersucht, inwieweit die Fusionsproteine eine Immunantwort gegen das Tumorantigen auslösen können. Die Vakzinierung von Balb/c Mäusen mit den CTLA-4 Fusionsproteinen bewirkte die Abstoßung anschließend subkutan injizierter syngener ErbB2-positiver Nierenkarzinomzellen (Renca-lacZ/ErbB2) nach subkutaner Injektion. Dies deutet auf die Erzeugung protektiver Immunität hin. Obgleich beide Fusionsproteine effektiv waren, zeigte das Fusionsprotein C-ErbB2(N), dem die bakterielle Translokationsdomäne fehlt, in mehreren unabhängigen Experimenten eine höhere Wirksamkeit als C-E-ErbB2(N). Vakzinierung mit den CTLA-4 Fusionsproteinen erzeugte keinen Schutz gegen ErbB2-negative Kontroll-Tumorzellen. Dies Experimente zeigt die Antigen-Spezifität der induzierten Immunantwort nach Vakzinierung mit CTLA-4 Fusionsproteinen. T-Zell Depletionsexperimente ergaben, dass die protektiven Effekte eindeutig von CD8+ CTLs abhängig waren. Eine erneute, diesmal intravenöse Applikation von ErbB2+ Tumorzellen in vakzinierte, tumorfreie Mäuse zwei Monate nach der ersten, subkutanen Injektion („Re-challenge“) führte nicht zur Ausbildung von Lungenmetastasen. Dies deutet darauf hin, dass durch die Vakzinierung eine langanhaltende Immunreaktion induziert wurde. In therapeutischen Vakzinierungsexperimenten, die wohl am ehesten eine klinische Situation in Tumorpatienten widerspiegeln, wurden die CTLA-4 Fusionsproteine in die Umgebung bereits etablierter subkutaner Renca-lacZ/ErbB2 Tumoren injiziert. In zwei unabhängigen Experimenten konnte gezeigt werden, dass durch die therapeutische Vakzinierung mit CErbB2(N) 7 von 8 Mäusen geheilt werden konnten, wohingegen die Wirkung von C-EErbB2(N) – von 8 Mäusen wurden 6 geheilt – auch im therapeutischen Einsatz etwas schwächer zu sein schien. Nach einem intravenösen „Re-challenge“ mit Renca-lacZ/ErbB2 Zellen waren bereits geheilte Tiere auch vor der Ausbildung von Lungenmetastasen geschützt. Dies bestätigt eine durch die Vakzinierung hervorgerufene lang-anhaltende Anti-Tumor Immunität. Alternativ zur Produktion rekombinanter Proteinvakzine in Bakterien wurde auch die direkte Injektion von DNA-Konstrukten zur in vivo Expression und Sekretion der CTLA-4 Fusionsproteine getestet (DNA-Vakzinierung). Basierend auf dem Plasmid pSecTag2 wurden Säugerzell-Expressionsvektoren hergestellt, welche unter der Kontrolle eines CMVPromotors die beiden Fusionsproteine C-ErbB2(N) bzw. C-E-ErbB2(N) kodieren. Ein Igk “leader” Signalpeptid ermöglicht hierbei die Sekretion der produzierten Proteine. Nach Transfektion der Plasmide in COS-7 Zellen konnte Sekretion der CTLA-4-Fusionsproteine in den Zellkulturüberstand sowie deren Zellbindungsspezifität für B7, mit Hilfe von Western-Blot und FACS-Analysen nachgewiesen werden. Protektionsexperimente ergaben, dass alle Balb/c Mäuse, die vorher durch intramuskuläre Injektion der CTLA-4-ErbB2 DNA-Vakzine vakziniert wurden, vor dem Anwachsen subkutan injizierter Renca-lacZ/ErbB2 Tumorzellen geschützt waren. Mäuse, die als Kontrolle mit dem leeren pSecTag2 Vektor vakziniert wurden, entwickelten dagegen schnell wachsende Tumoren. In diesem ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass chimäre Proteinvakzine, die in einer einzigen Polypeptidkette eine Zellerkennungsdomäne zur spezifischen Bindung an APCs und ein antigenes Proteinfragment aus dem humanen ErbB2 enthalten, in vivo eine äußerst wirkungsvolle ErbB2-spezifische T-Zell vermittelte Anti-Tumor Immunantwort auslösen. Hierbei konnte sowohl durch die Injektion von rekombinanten, in Bakterien hergestellten Proteinen, wie auch durch DNA-Vakzinierung zur in vivo Produktion dieser chimären Proteinvakzine erreicht werden, dass syngene, ErbB2 exprimierende Tumoren abgestoßen wurden. Die oben beschriebenen chimären Proteinvakzine enthalten ein großes Proteinfragment, abgeleitet aus einem humanen Tumorantigen, welches zu APCs befördert und von ihnen aufgenommen wird. Dieser Ansatz ist nicht unbedingt abhängig von einem bestimmten MHCTyp und möglicherweise besonders dann wirkungsvoll, wenn Immunantworten gegen Antigene erzeugt werden sollen, für die noch keine von MHC-Molekülen präsentierten Peptide identifiziert sind. Für Tumorantigene, aus welchen bereits einzelne Peptide als potentielle Tumorabstoßungs-Antigene definiert sind, wurden in einzelnen Fällen synthetische Derivate solcher Peptide erfolgreich eingesetzt, um hochspezifische T-Zell Antworten zu erzeugen. Aber auch in diesem Fall könnte die Verknüpfung des Antigens mit einem geeigneten „Antigen-Carrier“ eine verbesserte Aufnahme und Präsentation durch APCs und eine Verstärkung der Immunantwort gegen das Antigen zur Folge haben. Aus diesem Grund wurde in einem alternativen Ansatz zur Induktion einer ErbB2-spezifische Anti-Tumor Immunität die in vivo Anwendung von synthetischen Vakzin-Komplexen untersucht, welchen ein liposomaler Träger als Vektor für Peptid-Antigene zugrunde liegt. Diese Peptide sind über einen immunstimulatorischen Lipopeptid-Anker (Pam3CysSerSer) mit der Oberfläche solcher Liposomen verknüpft. Dieser Teil der Arbeit wurde in enger Kollaboration mit Audrey Roth, Dr. Benoit Frisch und Dr. Francis Schuber, Laboratoire de Chimie Bioorganique, Faculté de Pharmacie, Université Louis Pasteur (ULP), Strasbourg ausgearbeitet, die alle in dieser Arbeit verwendeten liposomalen Vakzine konstruierten und für in vivo Untersuchungen bereitstellten. Zwei liposomale Substanzen wurden synthetisiert. Ein Mono-Epitop Konstrukt, als „Tc-ErbB2-liposomes“ bezeichnet, trägt ein Tc-Epitop (TYLPTNASL), welches sich von der Aminosäuresequenz des humanen ErbB2 Moleküls ableitet. Es war bereits vorher gezeigt worden, dass dieses Peptid mit hoher Affinität an das murine H-2Kd MHC-Klasse I Molekül bindet und eine Peptid-spezifische CTL Immunantwort in Balb/c Mäusen auslösen kann. Die zweite liposomale Substanz, als „Tc-ErbB2/Th-liposomes“ bezeichnet, enthält zusätzlich zum ErbB2-Peptid noch ein universelles Th-Epitop, das sich vom Influenza Virus Hämagglutinin (HA 307-319) ableitet und ebenfalls über den adjuvanten Anker mit dem Liposom verbunden ist. Durch das Hinzufügen des Th-Epitops wurde beabsichtigt, zusätzlich CD4+ Helfer TZellen zu rekrutieren und damit die CTL Antwort gegen das Tc-Epitop zu verstärken. Durch ex vivo Restimulation von Milzzellen aus zuvor mit den liposomalen Konstrukten vakzinierten Tieren mit dem ErbB2-Peptid konnte die in vivo Aktivierung Tc-spezifischer CTLs nachgewiesen werden. In dem gleichen immunkompetenten Balb/c Maus-Modell, das auch zur Charakterisierung der CTLA-4-ErbB2 Proteinvakzine verwendet worden war, wurde auch die anti-tumorale Aktivität der liposomalen Komplexe untersucht. Die Vakzinierung von Balb/c Mäusen mit beiden Konstrukten, Tc-ErbB2-liposomes und Tc-ErbB2/Th-liposomes, führte zur Abstoßung anschließend subkutan injizierter ErbB2 exprimierender RencalacZ/ErbB2 Zellen. Eine therapeutische Vakzinierung von Mäusen, die bereits etablierte ErbB2+ Tumoren trugen, führte zu einem verlangsamten Wachstum in einigen und zur kompletten Abstoßung in den übrigen Tieren. In Kontrolltieren, die lediglich mit dem liposomalen Träger vakziniert waren, konnten keinerlei Tumorregression beobachtet werden. Während beide liposomalen Substanzen sowohl bei der protektiven als auch bei der therapeutischen Vakzinierung Anti-Tumor Effekte zeigten, verstärkte das Hinzufügen des Th-Epitops zu den „Tc-ErbB2 liposomes“ sowohl die ErbB2-spezifische Immunantwort als auch die Anti-Tumor Immunität. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung einer synergistischen CD4+ T-Zell Aktivierung als Teil von Anti-Tumor Immunantworten. Unabhängig von ihrer unterschiedlichen Wirkungsweise und chemischen Zusammensetzung stellen beide in dieser Arbeit untersuchten Vakzinkomplexe effektive Tumorvakzine dar, die nach ihrer Anwendung in vivo ErbB2-spezifische, T-Zell vermittelte Anti-Tumor Immunantworten auslösen können. Die chimären Fusionsprotein-Vakzine enthalten ein großes antigenes Proteinfragment. Durch ihre spezifische Zellbindungsdomäne wird der zielgerichtete Transport zu und die Aufnahme des Antigens in APCs, gefolgt von in vivo Prozessierung des Proteins in kleine antigene Peptide, MHC-Präsentation und schließlich Aktivierung tumorspezifischer T-Zellen gewährleist. Dieser Ansatz könnte insbesondere dann nützlich sein, wenn für das jeweilige Tumorantigen noch keine passenden T-Zell Epitope charakterisiert sind. Ein zusätzlicher Vorteil dieser Konstrukte ist, dass in einem einzigen Vakzin mehrere unterschiedliche antigene Determinanten bereitgestellt werden können. Für eine Reihe von Tumorantigenen sind bereits einzelne Peptide als potentielle Tumorabstoßungs-Antigene charakterisiert worden. Die in dieser Arbeit beschriebenen neuartigen liposomalen Träger, welche zusätzlich zum Tc-Epitop einen immunstimulatorischen Anker und ein starkes Th-Epitop tragen, könnten dazu beitragen, die Immunogenität und die anti-tumorale Aktivität synthetischer Peptid-Vakzine zu erhöhen.
• Tumor-specific T lymphocytes are being regarded as a highly effective mechanism for tumor rejection. Activation of tumor-specific cytotoxic CD8+ T cells (Tc or CTLs) requires presentation of tumor antigens by professional antigen presenting cells (APCs) via MHC class I molecules. Due to this crucial role in T-cell activation, APCs are being exploited for active cancer immunotherapy. Independent of CTLs, also CD4+ helper T cells (Th) can mediate a number of anti-tumor effector pathways. Activation of CD4+ T cells requires the presentation of antigen via MHC class II. So far only a limited number of MHC class II-presented, tumorspecific Th-epitopes have been identified. Therefore most current vaccination strategies are focusing on the use of defined Tc epitopes able to elicit tumor-antigen specific CTL responses. Such strategies include vaccines based on tumor-specific peptides, proteins or protein fragments, or DNA constructs encoding such tumor antigens. Since these reagents on their own are usually poorly immunogenic, they need to be administered together with an adjuvant to stimulate sufficiently strong immune responses. Dendritic cells (DCs), due to their ability to initiate primary immune responses, are the most efficient APCs and can be regarded as "nature’s adjuvant". Vaccine development therefore focuses more and more on exploiting the unique capabilities of DCs. Present experimental studies include loading of DCs with synthetic, tumor-specific peptides or tumor lysates, to achieve uptake of tumor antigens and presentation in the context of MHC molecules. However, while such vaccination approaches in some cases yielded promising results, they are associated with laborious and cost-intensive ex vivo processing of primary cells and, in the case of peptide antigens, are restricted to well-defined T-cell epitopes known to match the patient’s MHC haplotype. Therefore constructs that directly target vaccines to DCs in vivo and/or deliver a number of different T-cell epitopes, are highly desirable and might overcome some of the limitations of present approaches. The optimization of vaccine delivery can be expected to improve efficacy, reduce doses and the risk of side effects, and improve control of immunological outcome. In this thesis, construction and functional characterization of two novel types of cancer vaccines are described. These vaccines were designed to be applicable for in vivo vaccination and induction of anti-tumor immunity specific for the tumor-associated antigen ErbB2 (HER2/neu). ErbB2 is overexpressed in a variety of human malignancies including breast and ovarian carcinomas, and adenocarcinomas of the lung. Other types of carcinomas that show variable ErbB2 overexpression are those of the colon, kidney, bladder and salivary gland, prostate and pancreas. The first type of cancer vaccines intended to improve uptake and presentation of tumor antigen by APCs is based on the intracellular delivery of an antigenic determinant as part of a fusion protein specifically targeted to cell surface molecules exclusively expressed on APCs. As a potential cell targeting domain, a fragment derived from the extracellular part of the B7 counter receptor CTLA-4 (CTLA-4125) was chosen and expressed as a recombinant protein in E. coli. By FACS analysis, soluble human CTLA-4125 purified from bacterial lysates could be shown to bind specifically to murine and human B7 molecules selectively expressed on APCs, suggesting that CTLA-4125 could serve as an effective targeting domain for the delivery of tumor antigens to APCs. As chimeric protein vaccines for targeted delivery to APCs, two fusion proteins termed C-ErbB2(N) and C-E-ErbB2(N) were constructed, that comprise CTLA-4125 at the N-terminus for binding to B7, and a fragment from the extracellular part of the human tumor-associated ErbB2 antigen (ErbB2(N), amino acid residues 1-222) at the C-terminus. In the C-E-ErbB2(N) protein, between cell targeting domain and antigenic determinant the translocation domain of Pseudomonas exotoxin A (ETA II) was included to enable endosome escape upon receptor-mediated uptake of fusion protein by APC, possibly resulting in preferential delivery to the MHC class I pathway. Chimeric CTLA-4-ErbB2 fusion proteins were expressed in E. coli and purified from bacterial lysates by metal chelate affinity chromatography. Specific binding to B7 molecules on the surface of cells and uptake of the recombinant antigen-carrier proteins by B7 expressing human Raji cells could be demonstrated by FACS analysis and laser scanning microscopy. Immune responses induced by CTLA-4-ErbB2 fusion proteins were analyzed in Balb/c mice. Ex vivo restimulation with an ErbB2 derived peptide of splenocytes from animals vaccinated with the chimeric proteins led to enhanced IFN-g production by T cells. Subcutaneous challenge of Balb/c mice with syngeneic ErbB2+ renal carcinoma cells (Renca-lacZ/ErbB2) resulted in rejection of tumors by the majority of mice vaccinated with CTLA-4-ErbB2 fusion proteins indicating the induction of protective immunity. While both fusion proteins were effective, C-ErbB2(N) protein which lacks the bacterial translocation domain appeared to be more potent than C-E-ErbB2(N) in several independent experiments. Mice vaccinated with CTLA-4-ErbB2 fusion proteins were not protected against challenge with ErbB2 negative Renca-lacZ cells demonstrating specificity of the immune responses induced by the vaccines. T-cell depletion experiments showed that the protective effects were strictly dependent on the presence of CD8+ CTLs. Intravenous rechallenge of vaccinated, tumor-free animals two months after the first, subcutaneous tumor challenge did not result in the formation of lung metastasis suggesting that long-lasting immune responses had been induced. In therapeutic vaccination experiments more closely resembling a possible clinical situation, CTLA-4-ErbB2 fusion proteins were injected into the periphery of established, subcutaneously growing Renca-lacZ/ErbB2 tumors. In two independent experiments therapeutic vaccination with C-ErbB2(N) resulted in the cure of 7 out of 8 mice, whereas CE-ErbB2(N) also in a therapeutic setting appeared to be slightly less effective curing 6 out of 8 animals. Cured animals were also protected against intravenous re-challenge with RencalacZ/ErbB2 cells confirming the induction of long-lasting anti-tumor immunity. As an alternative to production of recombinant protein vaccines in bacteria, also direct injection of DNA constructs for in vivo expression and secretion of CTLA-4-ErbB2 fusion proteins was tested. Based on plasmid pSecTag2 mammalian expression vectors were constructed, which encode under the control of a CMV promoter the C-ErbB2(N) and C-EErbB2(N) proteins tagged for secretion with an Igk leader sequence. Upon transfection of COS-7 cells in tissue culture, secretion of CTLA-4-ErbB2 fusion proteins into the culture supernatant and B7 binding activity of such proteins could be confirmed by immunoblot and FACS analysis. In protective vaccination experiments, intramuscular injection of CTLA-4-ErbB2 DNA constructs in Balb/c mice resulted in complete protection from subcutaneous challenge with Renca-lacZ/ErbB2 tumor cells, whereas all animals vaccinated with pSecTag2 control DNA developed rapidly growing tumors. In conclusion, the data obtained in this first part of the thesis project demonstrate that chimeric protein vaccines combining in a single polypeptide chain a cell recognition domain for specific targeting to APCs with an antigenic protein fragment derived from human ErbB2 are effective in inducing ErbB2-specific, T-cell mediated anti-tumor immunity in vivo. Thereby both, injection of recombinant proteins produced in bacteria, and vaccination with mammalian expression plasmids for in vivo production of chimeric protein vaccines was effective resulting in the rejection of syngeneic, ErbB2 expressing tumors. The chimeric protein vaccines described above contain a large protein fragment derived from a human tumor antigen for delivery to and uptake by APCs. This approach is not necessarily dependent on a given MHC type and might be particularly useful to induce immune responses against antigens for which peptides suitable for presentation by most prevalent MHC alleles have not been defined. For tumor antigens where individual peptides have already been characterized as potential rejection antigens, in a limited number of cases synthetic derivatives of such peptides have successfully been used to induce T-cell responses of single specificity. However, also in this case inclusion of appropriate antigen carriers could facilitate improved uptake and presentation by APCs and enhance immunogenicity. Therefore in an alternative approach to induce ErbB2-specific anti-tumor immunity, in vivo application of synthetic vaccine complexes was investigated which are based on a liposomal carrier as a vector for peptide antigens linked to the liposomal surface via a special adjuvant lipopeptide anchor (Pam3CysSerSer). This part of the thesis project was carried out in close collaboration with Audrey Roth, Dr. Benoit Frisch and Dr. Francis Schuber, Laboratoire de Chimie Bioorganique, Faculté de Pharmacie, Université Louis Pasteur (ULP), Strasbourg, who prepared and provided all liposomal vaccine constructs tested in this study. Two liposomal formulations were synthesized. One single-epitope construct, referred to as Tc-ErbB2-liposomes, carried a Tc-epitope (TYLPTNASL) derived from the human ErbB2 amino acid sequence. This peptide has previously been shown to bind to murine H-2Kd MHC class I with high affinity and to elicit peptide-specific CTL responses in Balb/c mice. The second liposomal formulation, termed Tc-ErbB2/Th-liposomes, contained in addition to the ErbB2 peptide a universal Th-epitope derived from influenza virus hemagglutinin (HA 307-319) attached to the adjuvant anchor. Inclusion of the Th-epitope was intended to increase CTL responses against the Tc-epitope through additional recruitment of CD4+ T cell help. Both liposomal vaccines were able to induce activation of Tc-specific CTLs in vivo, as determined by ex vivo restimulation with the respective ErbB2 peptide of splenocytes from Balb/c mice vaccinated with the liposomal constructs. Using the immunocompetent Balb/c mouse model already employed for characterization of CTLA-4-ErbB2 protein vaccines, antitumoral activity of the liposomal complexes was investigated. Vaccination of mice with both constructs, Tc-ErbB2-liposomes and Tc-ErbB2/Th-liposomes resulted in protection of mice from subsequent subcutaneous challenge with ErbB2 expressing Renca-lacZ/ErbB2 cells. Therapeutic vaccination of mice bearing established ErbB2+ tumors with Tc-ErbB2-liposomes or Tc-ErbB2/Th-liposomes led to delayed tumor growth in some and complete tumor rejection in the remaining animals. In control animals treated with liposomal carrier no signs of regression were noted. While both liposomal formulations were effective in these protective and therapeutic vaccination experiments, addition of the Th-epitope to the Tc-ErbB2 liposomes enhanced both, ErbB2-specific CTL responses and anti-tumor immunity. This underscores the beneficial role of synergistic CD4+ T cell activation as part of anti-tumor immune responses. While different in their mode of action and chemical composition, both types of cancer vaccines investigated in this thesis project were effective and, upon in vivo application resulted in ErbB2-specific, T-cell mediated anti-tumor immunity. Chimeric protein vaccines containing a large antigenic protein fragment facilitate targeted delivery to and uptake by APCs, followed by in vivo processing of the proteins into small antigenic peptides for MHC presentation and activation of tumor-specific T cells. This approach might be particularly useful to induce immune responses against antigens for which peptides suitable for presentation by most prevalent MHC alleles have not yet been defined, or to apply as a single vaccine construct composite antigens consisting of different antigenic determinants. For tumor antigens where individual peptides have already been defined as potential rejection antigens, novel liposomal carriers containing in addition to the Tc-epitope an immunostimulatory lipopeptide anchor and a strong Th-epitope might provide a means to increase immunogenicity and enhance antitumoral activity of synthetic peptide vaccines.