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Igor Kovačević

• NOSTRIN belongs to the recently defined F-BAR protein family. F-BAR proteins are multi-domain proteins, which serve as adaptors between plasma membrane and cytoskeleton components in processes such as membrane protrusion formation, endocytosis and migration. NOSTRIN encompasses a F-BAR domain at the N-terminus, which mediates membrane association, followed by a HR1 motif and an intermediate domain (ID) domain in the middle, and a SH3 domain at the C-terminus. The domain architecture and ability to form oligomers enable NOSTRIN to coordinate several interaction partners namely dynamin, caveolin, N-WASP and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in the process of eNOS trafficking. In this context NOSTRIN was originally identified and hence termed eNOS traffick inducer. NOSTRIN is expressed in vascularized tissues (e.g. liver and lung) and in primary endothelial cells. Aims of the present work were (1) to investigate if NOSTRIN is involved in other processes besides eNOS trafficking, (2) to analyse the function of NOSTRIN in vivo through knockdown of NOSTRIN in developing zebrafish and (3) to study the consequences of the loss of NOSTRIN on signal transduction in a primary cell culture model derived from NOSTRIN knockout mice. To study the possible involvement of NOSTRIN in other processes besides eNOS trafficking a yeast two-hybrid screen was performed in which fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1) was identified as a putative novel interaction partner of NOSTRIN. In a series of yeast two-hybrid, pulldown and co-immunoprecipitation experiments the interaction between NOSTRIN and FGFR1 was confirmed to occur between endogenously expressed proteins and determined to be direct and to depend on the ID domain of NOSTRIN and the 130 C-terminal amino acid residues of FGFR1. FGFR1 is activated by binding of fibroblast growth factors (FGFs) and induces several different signal transduction pathways (e.g. MAPK and Akt pathway). Overexpression of NOSTRIN in HeLa cells specifically enhanced FGF2-dependent MAPK activation. Accordingly, depletion of NOSTRIN attenuated FGF2-dependent MAPK activation and did not affect FGF2-induced Akt activation. In summary, NOSTRIN has been identified as a novel interaction partner of FGFR1 involved in FGF2-dependent signal transduction. The morpholino oligonucleotide-mediated knockdown of NOSTRIN in developing zebrafish caused vascular leakage and irregular vascular patterning e.g. a loss of the proper trajectory of intersegmental vessel and interruptions of the dorsal longitudinal anastomotic vessel. The vascular phenotype was consistent upon use of two different morpholinos and could be rescued in a dose dependent manner by the injection of zebrafish NOSTRIN mRNA. Detailed analysis involving confocal and time lapse microscopy in zebrafish with endothelial specific expression of EGFP revealed that the knockdown of NOSTRIN impacts in vivo on the migration and morphology of endothelial tip cells and leads to a reduction of filopodia number and length. Additionally a NOSTRIN knockout mouse was generated. The analysis of FGFR1 signal transduction in primary mouse lung endothelial cells (MLECs) from NOSTRIN knockout and wild type mice revealed that FGF2-dependent MAPK activation was attenuated in MLECs isolated from NOSTRIN knockout mice when compared to MLECs isolated from wild type mice. The effect of NOSTRIN on FGF2-dependent signal transduction seems to be specific, since VEGF-induced MAPK activation was not affected in NOSTRIN knockout MLECs. The importance of NOSTRIN for FGF2 signal transduction in vivo is demonstrated by the greatly impaired angiogenic response to FGF2 in NOSTRIN knockout mice in matrigel plug assay. In a detailed biochemical analysis it was discovered that NOSTRIN interacts with the activated small GTPase Rac1 and that overexpression of NOSTRIN enhances Rac1 activation. Furthermore, the interactions of NOSTRIN with both Rac1 and its GEF Sos1 are required for NOSTRIN-mediated activation of Rac1. In accordance, activation of Rac1 was not detected upon FGF2 stimulation in NOSTRIN knockout MLECs. In conclusion, the present work describes a novel function of the F-BAR protein NOSTRIN in FGFR1 signal transduction. Data presented in this work demonstrate that NOSTRIN is required for the assembly of a complex consisting of FGFR1, Sos1 and Rac1 and subsequently for the FGF2-dependent activation of Rac1 in endothelial cells.
• Einleitung NOSTRIN gehört zur vor kurzem definierten Familie der F-BAR Proteine. F-BAR Proteine sind durch multiple Domänen kennzeichnet und dienen als Adaptorproteinen zwischen der Plasmamembran und Komponenten des Zytoskelettes bei der Bildung von Membranaustülpungen, bei der Endozytose sowie Migrationprozessen (Aspenström 2009). Die F-BAR Domänen bilden ein aus 6 antiparallelen Helices bestehendes bananenförmiges Dimer aus, so dass die konkave Oberfläche des F-BAR Dimers zahlreiche positiv geladene Arginin Reste beinhaltet über die F-BAR Proteine an Phospholipide der Zellmembran binden können (Tsujita, Suetsugu et al. 2006; Shimada, Niwa et al. 2007). Auf diese Weise können F-BAR Proteine die Krümmung von Membranen erkennen und induzieren und auch Ausstülpungen an großen synthetischen Liposomen hervorrufen (Itoh, Erdmann et al. 2005; Henne, Kent et al. 2007). Der Name NOSTRIN (eNOS traffick inducer) bezieht sich auf die urprüngliche Identifikation des Proteins beim subzellulären Trafficking der eNOS. NOSTRIN ist ein 506 Aminosäuren langes Protein und wird durch das Gen an Position 2q31.1 auf Chromosom 2 im menschlichen Genom kodiert (Zimmermann, Opitz et al. 2002). NOSTRIN mRNA wird in vaskularisierten Geweben wie der Plazenta, der Niere, der Lunge und dem Herz stark exprimiert. Auf Proteinebene wurde die Expression von NOSTRIN in humanen Endothelzellen nachgewiesen. Am N-Terminus weist NOSTRIN eine F-BAR Domäne auf und zusätzlich zu dieser FBAR Domäne besitzt NOSTRIN ein HR1 Motiv, eine intermediäre Domäne (ID) und am C-Terminus eine SH3 Domäne. Durch die Architektur der Domänen und die Fähigkeit Oligomere zu bilden, ist NOSTRIN in der Lage mehrere Interaktionspartner wie Dynamin, Caveolin, N-WASP und die endotheliale Stickstoffmonoxid Synthase (eNOS) zu koordinieren (Icking, Matt et al. 2005; Schilling, Opitz et al. 2006). Zielsetzung Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren (1) zu untersuchen ob NOSTRIN neben seiner Rolle im eNOS Trafficking an weiteren Prozessen beteiligt ist, (2) die Funktion von NOSTRIN in vivo zu analysieren mit Hilfe der Herrunterregulation von NOSTRIN im sich entwickelnden Zebrafisch und (3) die Konsequenzen des Verlusts von NOSTRIN auf Signaltransduktionsprozesse zu untersuchen durch Verwendung von primären Zellen, die aus einer NOSTRIN Knockout Maus gewonnen werden. Ergebnisse und Diskussion Um eine mögliche Beteiligung von NOSTRIN an Prozessen zusätzlich zum eNOS Trafficking zu untersuchen, wurde ein Hefe-Zwei-Hybrid System verwendet. Als Köderprotein wurden dabei die Aminosäuren 362-506 von NOSTRIN verwendet. Dieses Fragment von NOSTRIN umfasst einen Teil des HR1-Motivs, die ID Domäne und die SH3-Domäne. Im durchgeführten Hefe-Zwei-Hybrid Experiment wurde der Fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1) als potentieller Interaktionspartner von NOSTRIN identifiziert. Mit Hilfe von weiteren Hefe-Zwei-Hybrid Experimenten konnte die Interaktion von NOSTRIN und FGFR1 bestätigt werden und zudem konnte die Bindungsstelle von FGFR1 an NOSTRIN auf die ID Domäne festgelegt werden. Mit Hilfe von Ko- Immunpräzipitationen aus Säugerzellen konnte gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen NOSTRIN und FGFR1 auf Ebene endogen exprimierter Proteine erfolgt. Eine weitere Bestätigung der Interaktion von NOSTRIN und FGFR1 erfolgte durch GSTPulldown Experimente, die zeigten, dass endogen exprimierter FGFR1 an gereinigtes mit GST markiertes NOSTRIN bindet. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass es sich um eine direkte Interaktion handelt und dass die Interaktion abhängig von der ID Domäne von NOSTRIN (Aminosäuren 362-434) und den 130 C-terminalen Aminosäuren von FGFR1 (Aminosäuren 692-822) ist. Dazu wurde das GST markierte Fragment von FGFR1 gereinigt und in Pulldown Experimenten mit verschiedenen NOSTRIN Deletionskonstrukten verwendet. Die Aktivierung von FGFR1 erfolgt durch die Bindung von Wachstumsfaktoren (FGFs) und nach Aktivierung werden eine Vielzahl von Signaltransduktionswegen wie beispielsweise der MAP-Kinase Signalweg oder der Akt Signalweg in der Zelle induziert (Eswarakumar, Lax et al. 2005). Generell wird die FGFR1 Signaltransduktion durch zahlreiche Adaptorproteine wie FRS2a, Crk und Grb2 vermittelt (Groth and Lardelli 2002). Diese Adapterproteine rekrutieren weitere Proteine, die dann die nachfolgenden Signalkaskaden aktivieren (Eswarakumar, Lax et al. 2005) Um zu untersuchen, ob NOSTRIN die Rolle eines neuen Adapterproteins in der FGFR1 Signaltransduktion zukommt, wurde der Expressionlevel von NOSTRIN mittels Überexpression oder shRNA-vermittelter Herrunterregulation moduliert und die daraus resultierenden Veränderungen in der FGF2 induzierten MAP Kinase Aktivierung analysiert. Die Überexpression von NOSTRIN in HeLa Zellen führte zu einer spezifischen Erhöhung der FGF2-abhängigen Aktivierung des ERK1/2 Signalwegs. Dementsprechend schwächte der Verlust von NOSTRIN die FGF2-abhängige MAP-Kinase Aktivierung, hatte aber keinen Einfluss auf die FGF2-induzierte Aktivierung von Akt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass NOSTRIN als neuer Interaktionspartner von FGFR1 identifiziert wurde und an FGF2-abhängigen Signaltransduktionsprozessen beteiligt ist. Um die in vivo Funktion von NOSTRIN im Endothel zu untersuchen, wurde der Zebrafisch (Danio rerio) als Modelorganismus gewählt. Die transgenen Zebrafischlinien tg(fli1a:EGFP)y1 und tg(flk1:EGFP)s843 exprimieren enhanced green fluorescent Protein (EGFP) im Endothel und wurden daher in der vorliegenden Arbeit verwendet (Lawson and Weinstein 2002; Jin, Beis et al. 2005). Es wurden zwei verschiedene Morpholinos verwendet, um die Expression von NOSTRIN in Zebrafisch Embryonen herunter zu regulieren. Die Verwendung des ATG Morpholinos verhinderte die Translation von NOSTRIN und das Splice Morpholino inhibierte das Spleißen der NOSTRIN mRNA. Eine durch diese Morpholino-Oligonukleotide vermittelte Herrunterregulation von NOSTRIN im sich entwickelnden Zebrafisch verursachte eine Durchlässigkeit von Blutgefäßen und die Bildung eines irregulären Blutgefäß-Musters. Die intersegmentalen Gefäße (ISVs) in Wildtyp Embryonen bildeten das charakteristische segmentierte Muster aus und verküpften sich auf Ebene des Neuralrohrs, um die Struktur des dorsalen anastomotischen Gefäß (DLAV) zu bilden. Demgegenüber verzweigten sich die ISVs von Embryonen, die mit dem NOSTRIN ATG oder dem Splice Morpholino injiziert waren und verknüpften sich bevor sie die Ebene des Neuralrohrs erreichten, so dass das charakteristische Muster der parallelen ISVs gestört war. Zusätzlich war in Zebrafischen mit herunter reguliertem NOSTRIN die DLAV Struktur unterbrochen und einige der DLAV Segmente fehlten komplett. Darüber hinaus war die Kontinuität der kaudalen Arterie an mehreren Stellen unterbrochen und auch die Struktur und die Blutzirkulation des kaudalen Adergeflechts war verändert in den Zebrafischembryonen, in die NOSTRIN Morpholinos injiziert waren. Dieser vaskuläre Phänotyp war konsistent zu beobachten bei der Verwendung von zwei verschiedenen Morpholinos und durch die Injektion von NOSTRIN Zebrafisch mRNA konnte der normale Phänotyp konzentrationsabhängig wiederhergestellt werden. Die detaillierte Analyse von endothelspezifisch exprimiertem EGFP im Zebrafisch mittels Konfokalmikroskopie und Zeitrafferaufnahmen zeigte, dass die Herrunterregulation von NOSTRIN die Migration und die Morphologie von Tip- Zellen in vivo beeinflusst. Die Herrunterregulation von NOSTRIN führte zu einer Reduktion der Anzahl sowie Verkürzung der Filopodien. Desweiteren wurde eine NOSTRIN Kockout Maus generiert. Die Analyse der Signaltransduktion von FGFR1 in primären Endothelzellen isoliert aus Lungengewebe (MLECs) von NOSTRIN Knockout und Wildtyp Mäusen zeigte, dass die FGF2- abhängige MAP-Kinase Aktivierung erniedrigt war in MLECS isoliert aus NOSTRIN Knockout Mäusen im Vergleich zu Zellen isoliert aus Wildtyp Mäusen. Der beobachtete Effekt war spezifisch für die FGF2-abhängige Signaltransduktion, da die VEGFabhängige Signaltransduktion nicht verändert war in MLECS aus NOSTRIN Knockout Mäusen. In der nachfolgenden biochemischen Analyse wurde nachgewiesen, dass NOSTRIN über seine HR1 Motiv mit der aktiven Form der kleinen GTPase Rac1 interagiert. In der aktiven Form bindet Rac1 GTP, das dann im Folgenden durch die intrinsische GTPase Aktivität von Rac1 hydrolysiert wird. Die resultierende GDP-gebundene inaktive Form von Rac1 kann durch Guanin Nukleotid Austauschfaktoren (GEFs) wie beispielsweise Vav2, Tiam1, ELMO/DOCK180 oder Sos1 wieder aktiviert werden (Ridley 2001, Katoh, Hiramoto et al. 2006). Aktives Rac1 reguliert die Aktivität von zahlreichen nachgeschalteten Effektoren wie PAK und dem WAVE/Arp2/3 Komplex zur Vermittlung von Lamellipodien Bildung und Zellmigration (Pollard and Borisy 2003). Es konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von NOSTRIN zu einer verstärkten Aktivierung von Rac1 führt. Die Überexpression von NOSTRIN Deletionskonstrukten ohne HR1 Motiv oder ohne SH3 Domäne hatte keinen Einfluss auf die Rac1 Aktivität. Frühere Arbeiten aus der Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass NOSTRIN über seine SH3 Domäne mit Sos1 interagiert und daher ist es wahrscheinlich, dass sowohl die Interaktion mit Rac1 als auch mit Sos1 notwendig ist für die NOSTRIN vermittelte Aktivierung von Rac1. Schließlich wurde die Aktivität von Rac1 in primären MLECs untersucht, die aus Wildtyp und NOSTRIN Knockout Mäusen isoliert wurden. In diesen Experimenten induzierte die Stimulation mit FGF2 die Aktivierung von Rac1 in MLECs aus Wildtyp Mäusen, während in MLECs aus NOSTRIN Knockout Mäusen keine Aktivierung von Rac1 nach FGF2 Behandlung erfolgte. In in vivo Matrigel Versuchen bei den Wildtyp Mäusen induzierte FGF2 eine angiogentische Antwort und Endothelzellen konnten im Matrigel nachgewiesen werden. Demgegenüber konnten wesentlich weniger Endothelzellen im Matrigel bei NOSTRIN Knockout Mäusen nachgeweisen werden. Somit war die angiogenetische Antwort auf FGF2 stark verringert in den Matrigel Versuchen bei NOSTRIN Knockout Mäusen. Zusammenfassend ist NOSTRIN wichtig für die FGFR1 vermittelte Rac1 Aktivierung und auch für die Migration von Endothelzellen. Diese Idee wird durch die Ergebnisse der Versuche zur Rac1 Aktivität und die Matrigel Versuche bestätigt, da der Verlust von NOSTRIN die FGF2 abhängige Aktivierung von Rac1 verhinderte und ebenfalls die FGF2 induzierte angiogenetische Antwort reduzierte. Fazit Zusammenfassend beschreibt die vorliegende Arbeit eine neue Funktion des F-BAR Protein NOSTRIN bei der FGFR1 Signaltransduktion. Die Daten dieser Arbeit zeigen, dass NOSTRIN erforderlich ist für die Assemblierung eines Komplexes bestehend aus FGFR1, Sos1 und Rac1 und somit für die FGF2-abhängige Aktivierung von Rac1 in Endothelzellen benötigt wird.