Das onkogene Transformationspotential durch die "Gatekeeper"-Mutation T315I in Philadelphia-Chromosom assoziierten BCR/ABL-Fusionsproteinen

Die Entwicklung Philadelphia Chromosom-positiver (Ph+) chronischer myeloischer und
akuter lymphatischer Leukämie (CML und ALL) ist auf das Verschmelzen von ABL-und
BCR-Gensequenzen zurückzuführen. Die Bildung dieses BC
Die Entwicklung Philadelphia Chromosom-positiver (Ph+) chronischer myeloischer und
akuter lymphatischer Leukämie (CML und ALL) ist auf das Verschmelzen von ABL-und
BCR-Gensequenzen zurückzuführen. Die Bildung dieses BCR/ABL-Fusionsprotein führt
zu einer konstitutiv gesteigerten ABL-Tyrosinkinase-Aktivität mit der Folge einer
Deregulierung vielfältiger intrazellulärer Signalwege und der Induktion des
leukämischen Phänotyps.
Eine zielgerichtete Inhibierung von BCR/ABL mit Hilfe von ABL-Kinase-Inhibitoren
induziert Apoptose in BCR/ABL-transformierten Zellen und hat eine komplette
hämatopoetische Remission in Ph+ Leukämie-Patienten in der chronischen Phase zur
Folge. Eine große Zahl an Patienten mit fortgeschrittener Ph+ Leukämie erleidet
allerdings einen Rückfall und entwickelt Resistenzen gegen die molekularen
Therapeutika. Ein Hauptgrund für die Resistenzentwicklung sind Punktmutationen im
Bereich der ABL-Tyrosinkinase.
Die Punktmutation T315I ist als einzige Mutation gegen alle bisher entwickelten
Medikamente resistent. Sie ist auf eine Punktmutation von Threonin zu Isoleucin an
einer äußerst kritischen Stelle, der so genannten „Gatekeeper-Position“
zurückzuführen. Die T315I scheint nicht nur die Bindungsaffinität der Kinase-
Inhibitoren zu verhindern, sondern erzeugt zusätzliche Eigenschaften, die das
leukämogene Potential von BCR/ABL verstärken.
Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit war es daher, den Einfluss der T315I auf das
transformatorische Potential von BCR/ABL aufzuklären. Es konnte gezeigt werden, dass
die T315I sowohl bei p185BCR/ABL, als auch bei p210BCR/ABL zu einem gesteigerten und
Faktor-unabhängigen Wachstum führt. Zudem wurde im Rahmen einer Struktur-
Funktionsanalyse verdeutlicht, dass die T315I unabhängig von BCR-Sequenzen in der
Lage ist, Faktor-unabhängiges Zellwachstum in 32D- und Ba/F3-Zellen, aber nicht
klassisches Transformationspotential in Fibroblasten zu vermitteln.
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Ebenfalls war Gegenstand der experimentellen Arbeiten die Untersuchung, ob die
durch die T315I-vermittelte Resistenz gegenüber der Hemmung der Oligomerisierung
durch kompetitive Peptide von der Präsenz von BCR-Funktionsdomänen abhängt,
welche für die Aktivierung der Ras-Signalwege unerlässlich sind.
Es konnte nachgewiesen werden, dass die T315I-Punktmutation nur dann Resistenz
gegenüber der Hemmung der Oligomerisierung induziert, wenn BCR-Sequenzen als
Ausgangspunkt für den Ras-Signalweg (Tyr 177), in den verwendeten Konstrukten
vorhanden sind. Fehlen BCR-Sequenzen, so hemmen die kompetitiven Peptide auch
T315I-positive BCR/ABL-Deletionsmutanten.
Darüber hinaus wurde im Rahmen dieser Arbeit versucht, neue Lösungsansätze in der
Grundlagenforschung aufzuzeigen, indem ein neuartiges Zellkultursystem mit drei BALL-
Patienten-abgeleiteten Langzeitkulturen (PDLTCs) angewendet wurde. Die CMPDLTC
trägt unmutiertes BCR/ABL, während die KÖ-PDLTC BCR/ABL-T315I positiv ist.
Als dritte PDLTC stand die CR als BCR/ABL-negative Zellkultur zur Verfügung.
Zum ersten Mal war es mit Hilfe dieses relevanten Zellmodells möglich, die
inhibitorische Wirkung des Helix-2-Peptids in primären ALL-PDLTCs zu überprüfen.
Es konnten die bisherigen Ergebnisse aus den murinen Zelllinien zur Wirkung der
Hemmung der Oligomerisierung bestätigt werden, da auch in diesem Modell die Zellen
mit T315I-BCR/ABL resistent gegenüber den kompetitiven Peptiden waren.
Zusammenfassend lassen die Daten dieser wissenschaftlichen Arbeit die
Schlussfolgerung zu, dass die Punktmutation T315I nicht zum Schwerpunkt in der
Erforschung weiterer molekularer Therapeutika erklärt werden sollte. Vielmehr scheint
es in naher Zukunft von äußerster Bedeutung zu sein, besonders die Kaskade der
aberranten Signaltransduktionswegen mit dem Ausgangspunkt in wesentlichen BCRFunktionsdomänen
zu inhibieren.
Außerdem stellen die primären Patienten-abgeleiteten Langzeitkulturen eine
Möglichkeit dar, die Wirkung neuer molekularer Therapeutika effektiv zu überprüfen
und die Pathogenese von Ph+ Leukämien noch besser zu verstehen.
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The development of Philadelphia chromosome positive (Ph+) chronic myeloid
leucaemia (CML) and acute lymphoid leucaemia (ALL) is attributed by the fusion of BCR
and ABL gene sequences. The forming of this BCR/ABL fusion
The development of Philadelphia chromosome positive (Ph+) chronic myeloid
leucaemia (CML) and acute lymphoid leucaemia (ALL) is attributed by the fusion of BCR
and ABL gene sequences. The forming of this BCR/ABL fusionprotein leads to a
constitutive elevated activation of ABL tyrosine kinase with the consequence of a
deregulation of varied different intracellular signaling pathways. The fact of these
cases leads to the induction of an oncogene phenotyp of Ph+ leucaemia diseases.
The molecular targeting of BCR/ABL by ABL kinase inhibitors induces apoptosis in
BCR/ABL transformed cells and causes complete haematopoietic remission in patients
in the chronic phase of leucaemia. Unfortunately a large number of patients in the
accelerated phase suffer from a relapse and develop resistence against molecular
compounds like Imatinib. One main reason for the emergence of resistence is the
emergence of pointmutations in the area of the ABL tyrosine kinase.
The pointmutation T315I is the only mutation which is resistant against all up to now
developed molecular inhibitors. It is due to a substitution of threonine to isoleucin in a
very critical place, called “gatekeeper position”. It seems T315I is not only able to
interrupt the binding affinity of kinase inhibitors, but also confers additional features
to BCR/ABL, which enforce its leucaemic potential.
The aim of this scientific work was therefore to clarify the influence of T315I on the
transformational potential of BCR/ABL. It was shown that the pointmutation both
improve the factor independence of p185BCR/ABL and the ability to grow factor
independent from p210BCR/ABL. Additional to this a structure function analysis was
made which illustrate that T315I is able to restore factor independent growth in 32D
and Ba/F3 cells, but not to confer transformation potential of fibroblasts in a classical
term.
Another point of this experimental work was the analysis whether the resistence
through the pointmutation T315I against the inhibitory of the oligomerization
mediated by competitive peptids is depending on the presence of functional BCR
domains, which are essential for the activation of the Ras-signaling pathway.
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It was evidenced that T315I only induce resistence against inhibitoring the
oligomerization if BCR sequences as initial point for Ras-signaling (Tyr 177), are
available in the cDNA constructs we have used. In the case of missing BCR sequences
T315I is not able to confer resistence, therefore competitive peptids can inhibit the
growth of T315I positive BCR/ABL deletion mutants.
Over that it was tried to find new solution attempts in basic research by using a new
cell cultur system with three B-ALL patient-derived long-term cultures (PDLTCs). CMPDLTC
is BCR/ABL unmutated, whereas KÖ-PDLTC is T315I-mutated. Thirds we used CR
as a BCR/ABL negative PDLTC.
For the first time with this new relevant type of cell culture the possibility was given to
examine the inhibitory impact of the oligomerization domain by the Helix-2-peptide.
It was possible to confirm our previous results in murine cell lines with Helix-2,
because the pointmutation T315I conferred resistence against inhibiting the
oligomerization of BCR/ABL in PDLTCs.
In summary the recent findings of this scientific work allows the conclusion the
pointmutation T315I can not longer be seen as the focus of research interest of
developing further new targeted molecular compounds. Rather it seems in near future
it will be of interest to inhibit the cascade of aberrant signaling pathways with the
starting point in essential functional BCR domains.
Out of this the new primary patient-derived long-term cultures create an innovative
opportunity to examine the side effects of new developed molecular compounds in
human cells and to understand the pathogenesis of Ph+ leucaemias in a better way.
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Metadaten
Author:Marion Schüll
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-255856
Referee:Martin Ruthardt, Peter Bader
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2012/11/21
Year of first Publication:2010
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2011/05/12
Release Date:2012/11/21
Pagenumber:119 S.
Note:
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS PPN:312867921
Institutes:Medizin
Dewey Decimal Classification:610 Medizin und Gesundheit
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License LogoArchivex. zur Lesesaalplatznutzung § 52b UrhG

$Rev: 11761 $