Untersuchungen zur Bedeutung von NOSTRIN in der Leberzirrhose und Charakterisierung einer neuen NOSTRIN-Isoform

Die endotheliale NO-Synthase (eNOS) ist im kardiovaskulären System der Hauptproduzent von Stickstoffmonoxid (NO). Studien deuten auf eine Beteiligung der eNOS im Krankheits-verlauf einer Leberzirrhose hin; zirrhotische T
Die endotheliale NO-Synthase (eNOS) ist im kardiovaskulären System der Hauptproduzent von Stickstoffmonoxid (NO). Studien deuten auf eine Beteiligung der eNOS im Krankheits-verlauf einer Leberzirrhose hin; zirrhotische Tiere zeigen eine reduzierte hepatische eNOS-Aktivität bei unveränderten Proteinmengen. Die reduzierte NO-Menge trägt zu einer Erhöh-ung des intrahepatischen Widerstandes und einer portalen Hypertonie bei. Inhibitoren und posttranslationale Modifikationen der eNOS wurden als auslösende Faktoren postuliert, aber auch am intrazellulären Transport der eNOS beteiligte Proteine könnten eine wichtige Rolle spielen. Ein solches ist das neue Protein NOSTRIN (“eNOS traffic inducer”), das über seine C-terminale SH3-Domäne an eNOS bindet und durch seine N-terminale FCH Domäne an Membranen assoziiert. In vorhergegangenen Studien wurde nur ein translatiertes Protein identifiziert, bezeichnet als NOSTRINalpha. In der vorliegenden Arbeit habe ich eine verkürzte Isoform entdeckt (NOSTRINbeta), die aus einem alternativen Spleißvorgang hervorgeht. Ihr fehlt fast die gesamte FCH Domäne, wodurch keine Membranbindung mehr stattfindet. Diese Isoform konnte nur in pathogenem Lebergewebe nachgewiesen werden. Untersuchun-gen mittels Western Blotting und qRT-PCR mit Proben aus Patienten mit Zirrhose, alkoholischer Hepatitis oder von gesunden Personen, zeigten eine deutliche Erhöhung der Expression beider NOSTRIN-Isoformen von gesundem zu zirrhotischem Gewebe. NOSTRINalpha mRNA-Mengen waren in zirrhotischen vs. gesunden Proben verdoppelt, und in Proben aus Patienten mit zusätzlicher Hepatitis verdreifacht. Dies deutet darauf hin, dass erhöhte Mengen von NOSTRINalpha zu einer Internalisierung und Inaktivierung der eNOS führen könnten. NOSTRINalpha und NOSTRINbeta wurden ebenfalls in Hep3B-Zellen auf Protein und mRNA-Ebene nachgewiesen, ihre Expression war durch Retinsäure zeit- und dosisabhängig stimulierbar. NOSTRINalpha lokalisiert an Plasmamembran und vesikulären Strukturen, NOSTRINbeta hingegen hauptsächlich im Zellkern, eine geringe Fraktion im Zytosol. Über Kartier-ungsstudien wurden zwei nuclear leading sequences (NLS) identifiziert, die den Transport in den Zellkern vermitteln, sowie eine Crm-1-abhängige nuclear export sequence (NES). Im EMSA konnte die Bindung von NOSTRINbeta an die Promotorregion des NOSTRIN-Gens gezeigt werden. Diese Ergebnisse legen eine Funktion von NOSTRINbeta als Transkriptionsfaktor nahe, evtl. innerhalb einer negativen Rückkopplung auf die NOSTRINalpha-Expression. Weiter-führende Studien sollen diesen potentiellen molekularen Mechanismus im Detail klären.
show moreshow less
Endothelial nitric oxide synthase (eNOS) is the major NO-producing (nitric oxide) enzyme in the cardiovascular system that contributes to vascular homeostasis. Accumulating evidence suggests a pathogenetic role for eNOS 
Endothelial nitric oxide synthase (eNOS) is the major NO-producing (nitric oxide) enzyme in the cardiovascular system that contributes to vascular homeostasis. Accumulating evidence suggests a pathogenetic role for eNOS in the development of liver cirrhosis. Cirrhotic animals display reduced enzymatic activity of eNOS though its protein level is unchanged. The re-duction in hepatic NO generation contributes to increased intrahepatic resistance and elevated portal pressure. Inhibitors and post-translational modifications of eNOS have been postulated as pathogenetic factors, however proteins regulating the intracellular trafficking of eNOS may also play a crucial role. One such protein termed NOSTRIN (for eNOS traffic-inducer) is a novel multi-domain protein that binds to eNOS via its C-terminal SH3 domain and attaches to membranes through its N-terminal FCH domain. Previous work have only identified the full-size form of NOSTRIN (referred to as NOSTRINalpha). In the present work, I have identified a truncated isoform of NOSTRIN (dubbed NOSTRINbeta), which results from alternative splicing and lacks the most of the FCH domain and therefore does not attach to membranes. This isoform is only present in diseased liver tissues. Expression levels of NOSTRINalpha and NOSTRINbeta analyzed by Western Blotting and qRT-PCR in liver samples of patients with severe cirrhosis, alcoholic hepatitis or healthy liver revealed that both NOSTRIN isoforms are upregulated in cirrhotic as compared to normal liver. NOSTRINalpha mRNA levels were doubled in cirrhotic vs. normal samples, and three times as high in samples from patients with additional hepatitis, suggesting that increased levels of NOSTRINalpha may promote eNOS internalization and inactivation. NOSTRINalpha and NOSTRINbeta were also present in immortalized Hep3B cells both on mRNA and protein level, and their expression was stimulated in a time- and dose-dependent manner by retinoic acid. NOSTRINalpha was found at the plasma membrane and at vesicular structures, whereas overexpressed NOSTRINbeta mainly localized to the nucleus and only a minor fraction was present in the cytosol. Mapping studies identified two nuclear localization sequences (NLS) that target NOSTRINbeta to the nucleus, whereas a unique Crm-1-dependent nuclear ex-port sequence (NES) mediates nuclear export. EMSA revealed that NOSTRINbeta may bind to the NOSTRIN gene promotor region, indicating that the truncated NOSTRINbeta isoform may serve as a transcription factor which silences NOSTRINalpha expression in a negative feedback mechanism. Ongoing studies aim at dissecting these putative mechanism in molecular detail.
show moreshow less

Export metadata

  • Export Bibtex
  • Export RIS

Additional Services

    Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author:Anja Wiesenthal
URN:urn:nbn:de:hebis:30-52887
Referee:Bernd Ludwig
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2008/02/12
Year of first Publication:2007
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2007/10/31
Release Date:2008/02/12
HeBIS PPN:195374282
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:610 Medizin und Gesundheit
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

$Rev: 11761 $