Strukturelle Organisation und Mobilisierung des Primaten-spezifischen Non-LTR-Retrotransposons SVA

SVA-Elemente repraesentieren die juengste Familie der Non-LTR-Retrotransposons, 
welche das humane Genom fortwaehrend modifizieren. SVA-Elemente zeichnen sich 
durch ihre Organisation aus zusammengesetzten repetitiven 
SVA-Elemente repraesentieren die juengste Familie der Non-LTR-Retrotransposons, 
welche das humane Genom fortwaehrend modifizieren. SVA-Elemente zeichnen sich 
durch ihre Organisation aus zusammengesetzten repetitiven Elementen aus. Um 
Rueckschluesse auf den Assemblierungsprozess, der zur gegenwaertigen Organisation der 
SVA-Elemente fuehrte, und ueber transkriptionelle Regulation dieser Elemente zu ziehen, 
wurden Unterschiede in der Struktur der 116 SVA-Elemente, die auf humanem 
Chromosom 19 lokalisiert sind, detailliert untersucht.
SVA-Elemente konnten in sieben unterschiedliche Strukturvarianten eingeteilt werden, 
einschliesslich neuer Varianten wie SVA2, 3`-verkuerzte Elemente und Elemente mit 5`-
flankierenden Transduktionen. Ich habe auch eine extrem erfolgreiche human-spezifische 
5`-Transduktionsgruppe identifiziert, SVA_F1, die trotz ihres jungen evolutionaeren Alters 
ca. 32% aller Mitglieder der SVA-Subfamilie SVA_F umfasst. Die transkriptionelle 
Kontrolle einer retrotransponierten und 5`-verkuerzten SVA_F-Kopie durch den Promotor 
des MAST2-Gens diente als urspruengliches Source-Element dieser umfangreichen 5`-
Transduktionsgruppe, die mindestens 84 Elemente einschliesst. Die zusaetzlichen 5`- 
sowie 3`-Transduktionsereignisse der vollstaendigen Alu-Sequenzen bei Mitgliedern der 
SVA_F1-Transduktionsgruppe 4 weisen auf ihre wichtige Rolle in der erfolgreichen 
Expansion im humanen Genom hin. Diese nachtraeglich erworbenen Alu-Sequenzen 
machen SVA_F1-Familienmitglieder offensichtlich zum besseren Substrat fuer die Trans-
Mobilisierung durch die L1-Proteinmaschinerie. Die unterschiedlichen konsekutiven 5`-
Tansduktionsereignisse der SVA_F1-Familienmitglieder deuten auf transkriptionelle 
Kontrolle ihrer Source-Elemente durch eine Vielzahl externer zellulaerer Promotoren hin, 
die im Laufe der Evolution in Keimzellen aktiv waren. Ausserdem zeigt die Existenz von 
5`-Transduktionen, dass SVA-Elemente sich die 5`-flankierenden Sequenzen aneignen 
koennen. Die Daten zeigen auch, dass SVA-vermittelte 5-Tansduktionsereignisse 
alternatives RNA-Spleissen an putativen Spleissstellen involvieren. Aus der EST-
Datenbankanalyse ist ersichtlich, dass Mitglieder der SVA_F1-Subfamilie auch 
gegenwaertig transkribiert werden.
SVA-Elemente sind hoch aktiv im humanen Genom, aber der Mechanismus ihrer 
Retrotransposition wurde bislang nicht aufgeklaert. Vorangehende Analysen genomischer 
SVA-Kopien liessen auf eine L1-vermittelte Mobilisierung schliessen; allerdings wurde 
der experimentelle Beweis dieser Hypothese bislang nicht geliefert. Mit Hilfe der 
Zellkultur-basierten Trans-Mobilisierungsassays wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal 
experimentell bewiesen, dass SVA-Elemente tatsaechlich durch die L1-kodierten Proteine 
in trans mobilisiert werden. Zu diesem Zweck wurden HeLa-Zellen mit einem 
vollstaendigen oder mit einem 5`-verkuerzten SVA-Retrotranspositionsreporterkonstrukt 
sowie mit einem L1-Expressionsplasmid bzw. Leervektor kotransfiziert und dann die 
jeweiligen Raten der SVA-Retrotransposition anhand Neo-resistenter Kolonien, die 
mindestens ein de novo-Retrotranspositionsereignis widerspiegeln, bestimmt. Die 
Experimente zeigen, dass die Entstehung der Neo-resistenten Kolonien von der 
Koexpression L1-kodierter Proteine abhaengig ist. Ich konnte auch zeigen, dass das 
vollstaendige SVA-Testkonstrukt - im Gegensatz zum 5`-verkuerzten SVA-Konstrukt - 
mit einer signifikant hoeheren Retrotranspositionsrate als die Kontrollkonstrukte, die zur 
Generierung der prozessierten Pseudogenformation eingesetzt wurden, trans-mobilisiert 
wird. Die Ergebnisse der Trans-Mobilisierungsassays belegen, dass SVA-Elemente ein 
bevorzugtes Substrat fuer die L1-Proteinmaschinerie darstellen, und ihre 5`-Region 
einschliesslich der Alu-homologen Sequenz fuer die hohe Retrotranspositionsrate essentiell 
ist. Die elf analysierten SVA de novo-Integrationsereignisse weisen Merkmale der L1-
vermittelten Retrotransposition auf, wie Poly(A)-Enden, L1-EN-spezifische Konsensus-
Zielsequenz (NNAUNA), Zielsequenz-Verdoppelungen (TSDs), Mikrohomologien und 
zusaetzliche Guanosin-Nukleotide am 5`-UEbergang.
Zusammenfassend demonstrieren die Ergebnisse dieser Studien, dass ein signifikanter Teil 
der Mitglieder der human-spezifischen SVA-Subfamilie aus transkriptioneller Kontrolle 
ihrer Source-Elemente durch externe Promotoren hervorgeht. Durch die in dieser Arbeit 
durchgefuehrten in silico-Analysen wurde auch gezeigt, dass SVA-vermittelte 5`-
Transduktionsereignisse zur strukturellen Vielfalt der SVA-Elemente fuehren, und eine 
neue Art von genomischen Umstrukturierungen darstellen, die zur Plastizitaet des 
humanen Genoms beitragen. Ausserdem bestaetigen die Ergebnisse der Trans-
Mobilisierungsassays die Hypothese, dass SVA-Elemente tatsaechlich durch die L1-
kodierte Proteinmaschinerie trans-mobilisiert werden. Dabei sind Module am 5`-Ende der 
SVA-Elemente fuer diesen Prozess hoechst relevant.

Die Ergebnisse der Dualen-Luciferase-Reportergen-Assays unterstuetzen die Hypothese, 
dass innerhalb der SINE-R-Sequenz von SVA H19_27 cis-aktive Elemente vorhanden 
sind, die auf aehnliche Weise wie die cis-aktiven Elemente innerhalb der 5`LTR von 
HERV-K reguliert werden. 

Ausserdem wurde in dieser Arbeit die Existenz interner reguatorischer Sequenzen 
innerhalb der SVA-Sequenz bestaetigt. Mit Hilfe der Dualen-Luciferase-Reportergen-
Assays konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass SVA-Elemente cis-aktive Elemente 
enthalten, die hauptsaechlich in der SINE-R-Region lokalisiert sind. Diese cis-aktiven 
Elemente werden auf aehnliche Weise wie die cis-aktiven Elemente innerhalb der 5`LTR 
von HERV-K reguliert. Die starke transkriptionelle Aktivitaet des vollstaendigen SVA-
Testelements und des L1RP-Promotors in den Teratokarzinom-Zelllinien bekraeftigen die 
Annahme, dass haeufige SVA-Mobilisierung in Keimzellen durch die gleichzeitig 
hochregulierte SVA- und L1-Transkription bedingt sein koennte.

Es konnte gezeigt werden, dass SVA-Elemente cis-aktive Elemente enthalten, die 
hauptsaechlich in der SINE-R-Region lokalisiert sind, und auf aehnliche Weise wie die cis-
aktiven Elemente innerhalb der 5`LTR von HERV-K reguliert werden. Die starke 
transkriptionelle Aktivitaet des vollstaendigen SVA-Testelements und des L1RP-Promotors 
in Teratokarzinom-Zelllinien bestaetigen die Annahme, dass haeufige SVA-
Retrotransposition in Keimzellen durch die gleichzeitig hochregulierte SVA- und L1-
Transkription bedingt sein koennte.
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Metadaten
Author:Julija Raiz
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-262894
Referee:Gerald G. Schumann, Anna Starzinski-Powitz
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2011
Year of first Publication:2011
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2011/07/07
Release Date:2012/09/13
Pagenumber:220 S.
Note:
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
Institutes:Biowissenschaften
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität; nur lokal zugänglich)
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$Rev: 11761 $