Identifizierung neuer antibiotischer Substanzen mittels verschiedener Bioassays und Massenspektrometrie / von Dorota Anna Urbanek

In dieser Arbeit sollten auf Grundlage eines in vitro Transkriptions-/Translations-Assays
(TTA) neue Substanzen als Hemmer der bakteriellen Proteinbiosynthese gefunden werden.
Um dieses Ziel verfolgen zu können, wurde 
In dieser Arbeit sollten auf Grundlage eines in vitro Transkriptions-/Translations-Assays
(TTA) neue Substanzen als Hemmer der bakteriellen Proteinbiosynthese gefunden werden.
Um dieses Ziel verfolgen zu können, wurde zuerst ein zellfreies Testsystem aus
kommerziellen Komponenten entwickelt und als Screening-Tool für Inhibitoren der
bakteriellen Proteinbiosynthese evaluiert. Anhand des allgemein akzeptierten
Bewertungskriteriums Z‘-Faktor konnte die Performance des etablierten Assays als exzellent
eingeordnet werden. Mit diesem System war es nun möglich, Substanzen aus
unterschiedlichen Quellen bei der Wirkstoffsuche als potentielle Antibiotika einzuordnen,
welche die Proteinbiosynthese hemmen.
In zwei nachfolgenden Projekten wurde die Praktikabilität dieses neuen Assays bei der
Auffindung möglicher Antibiotika-Kandidaten bewiesen. In dem ersten Ansatz wurde ein
virtuelles Screening der Substanzdatenbanken Specs und Asinex anhand eines
Pseudorezeptormodells für Aminoglykoside durchgeführt. In Kombination mit dem TTA
sowie einem Ganzzell-Assay gegen den gram-positiven Keim Bacillus subtilis 168 konnte
eine Struktur mit Ähnlichkeit zu Vanilloiden als interessanter Ausgangspunkt für
weitergehende Untersuchungen identifiziert werden. Die Entdeckung korreliert mit den
antimikrobiellen Eigenschaften eines anderen Vanilloid, dem Capsaicin, für welches bisher
aber keine Hemmung der Proteinbiosynthese in der Literatur beschrieben ist. Somit konnte
gezeigt werden, dass anhand eines virtuellen Screenings sowie weiterer Assays neue Hemmer
der bakteriellen Proteinbiosynthese effizient und effektiv gefunden werden können.
In einem zweiten Screening-Projekt dienten pflanzliche Naturstoffe als Substanzquelle.
Hierfür wurden auf der Grundlage der diterpenoiden Fusidinsäure, einem
Proteinbiosynthesehemmer (PBS-Hemmer), tetra-und pentazyklische Isoprenoide ausgewählt.
Aus einem Ensemble von terpenoiden Strukturen gingen nach TTA und einem zellbasierten
Assay gegen Bacillus subtilis 168 in absteigender Aktivität die 18β-Glycyrrhetinsäure, 11-
Keto-β-boswelliaäsure und Carnosolsäure als nennenswerte antimikrobiell wirksame
Vertreter und PBS-Hemmer hervor. Auch zeigten sich diese Substanzen den Stoffen aus dem
virtuellen Screening sowohl im TTA als auch in der Wirksamkeit gegen Bacillus subtilis 168
deutlich überlegen.
Im nächsten Schritt erfolgte deshalb nur für diese drei Terpenoide eine Charakterisierung
ihrer Auswirkungen auf das Proteom des gram-positiven Bakteriums Bacillus subtilis 168.
Zusammenfassung
131
Dafür wurde eine komplette zweidimensionale gelelektrophoretische Methodik basierend auf
der Differentiellen Gelelektrophorese (DIGE) etabliert. Sie umfasst eine Strategie zur
schnellen Evaluierung der optimalen Anzucht des Testkeims Bacillus subtilis 168 unter
Einfluss einer antimikrobiell wirksamen Substanz und ein einfaches Aufschlussverfahren, um
einen kompatiblen Proteinextrakt für DIGE zu erhalten. Außerdem wurde ein preisgünstiges
Markierungsverfahren mit dem 5(6)-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimid-Ester als
Alternative zu den teuren DIGE-Cyan-Farbstoffen entwickelt, um die Fluoreszenzbildqualität
eines neuen unbekannten Extraktes vor dem eigentlichen kostspieligen DIGE-Versuch zu
überprüfen. Eine Quantifizierung regulierter Spots im Gel ist mit diesem billigen Verfahren
ebenfalls möglich, stellt aber keinen Ersatz für den DIGE-Versuch dar.
Die Ergebnisse der quantitativ vergleichenden Proteomanalyse vom behandelten und
unbehandelten Bacillus subtilis 168 mittels DIGE bieten erstmals einen Einblick in die
Einflussnahme der drei Terpenoide 18β-Glycyrrhetinsäure, 11-Keto-ß-boswelliaäsure und
Carnosolsäure auf die Stressregulation und die Stoffwechseländerungen dieses Bakteriums.
Außerdem beinhaltet die Arbeit einen Abgleich, inwieweit andere antimikrobiell wirksame
Substanzen die regulierten Proteine der drei untersuchten Naturstoffe bei Bacillus subtilis 168
beeinflussen können. Aus den erhobenen Daten konnte dann ein Wirkmechanismus für 18β-
Glycyrrhetinsäure und Carnosolsäure postuliert werden. 18β-Glycyrrhetinsäure greift
wahrscheinlich am membranständigen Lipid-II-System der bakteriellen Zellwand an, da wie
bei den Antibiotika Vancomycin, Nisin, Daptomycin, Ramoplanin und Bacitracin das
Zellwandstress-Regulationsnetzwerk (LiaRS-System) als Warnsystem aktiviert wird.
Außerdem konnte für 18β-Glycyrrhetinsäure und Carnosolsäure eine Theorie für Ihre PBSHemmung
entwickelt werden. Beide beeinflussen gegebenenfalls die GTPase-Aktivität des
Translationsfaktors EF-G durch Interaktion mit dem ribosomalen Bindezentrum für
Translationsfaktoren. Dieses Bindungszentrum ist neben der dekodierenden Region auf der
ribosomalen 30S-Untereinheit und dem Peptidyltransferase-Zentrum auf der ribosomalen
50S-Untereinheit eine extrem wichtige Region für die Funktionalität eines Ribosoms.
Fusidinsäure greift auch an dieser Stelle an, indem es den EF-G-GDP-Ribosomkomplex
stabilisiert. Natürlich wären weitere Studien nötig, z. B. eine Röntgenstrukturanalyse der
Ribosomen von 18β-Glycyrrhetinsäure und Carnosolsäure behandelten Bakterien, um die
Bindestelle für die PBS-Hemmung zweifelsfrei zu bestätigen.
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Metadaten
Author:Dorota Urbanek
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-263536
Publisher:Univ.-Bibliothek
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Michael Karas, Eugen Proschak
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2012/11/14
Year of first Publication:2011
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2012/10/19
Release Date:2012/11/14
Pagenumber:237
Last Page:222
Note:
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HeBIS PPN:347988814
Institutes:Pharmazie
Dewey Decimal Classification:610 Medizin und Gesundheit
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License LogoArchivex. zur Lesesaalplatznutzung § 52b UrhG

$Rev: 11761 $