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Susanne Täschner

• Die vorliegende Studie wurde durchgeführt, um den Einfluss der präanalytischen Temperatur- und Lagerungsbedingungen für die Bestimmung der VWF-Parameter eingehender zu untersuchen. Wir untersuchten bei 10 gesunden Personen, 10 Patienten mit von Willebrand-Syndrom Typ 1, 5 Patienten mit VWS Typ 2 und 10 Patienten der neurochirurgischen Klinik den Einfluss verschiedener Lagerungsbedingungen auf VWF:RCo, VWF:Ag, VWF:CB, APTT und FVIII:C. Pro Patient entstanden so folgende Proben: PS Das Blut (ein Röhrchen) wurde sofort zentrifugiert und der Überstand anschließend bei 80° C eingefroren. CR3/CR6 Das Citratblut (zwei Röhrchen) wurde für drei bzw. sechs Stunden bei Raumtemperatur gelagert, daraufhin zentrifugiert und eingefroren.. CE3/CE6 Das Citratblut (zwei Röhrchen) wurde für drei bzw. sechs Stunden in Eis gelagert, dann zentrifugiert und eingefroren. CK3/CK6 Das Citratblut (zwei Röhrchen) wurde für drei bzw. sechs Stunden zwischen zwei Kühlakkus gelagert, anschließend zentrifugiert und eingefroren. PR3/PR6 Der Plasmaüberstand aus einem Citratröhrchen wurde nach der Zentrifugation abpipettiert, auf zwei Reagenzgläser verteilt und für drei bzw. sechs Stunden bei Raumtemperatur gelagert und danach eingefroren. PE3/PE6 Der Plasmaüberstand aus einem Citratröhrchen wurde nach dem Zentrifugieren abpipettiert, auf zwei Reagenzgläser verteilt und für drei bzw. sechs Stunden in Eis gelagert und nachfolgend eingefroren. Wie man an Hand der Ergebnisse sehen kann, verursachte die gekühlte Lagerung von Citratvollblut teilweise dramatische Veränderungen der Ausgangswerte PS. Zusammenfassend fanden wir keine Kälteinduzierte Erniedrigung der VWF-Parameter im Plasma und bei Patienten mit VWS, Typ 2 ohne messbare Ristocetin-Cofaktor-Aktivität. Auf Grund dieser Ergebnisse nahmen wir an, dass der Kälte-induzierte Verlust der VWF-Parameter und der Faktor VIII-Aktivität zum einen die Gegenwart von Thrombozyten und zum anderen die Anwesenheit hochmolekularer vWF-Multimere benötigte. Wir vermuteten, dass es nur bei Anwesenheit von Thrombozyten und HMW-VWF zu einem hochgradig kälteinduzierten Verlust von VWF:RCo, VWF:Ag und FVIII:C kommt. Von Berger et al (1998) wurde bereits publiziert, dass sich die Thrombozyten bei Kälteeinwirkung in ihrer Zytoskelettstruktur verändern. Hoffmeister et al. (2003) konnten eine kälteinduzierte Zusammenlagerung der GPIb-Rezeptoren n der Thrombozyten-Zelloberfläche beobachten. Wir nahmen an, dass der kälteinduzierte Verlust des VWF auf eine durch Kälte geförderte Bindung des VWF an Thrombozyten, wahrscheinlich durch die gesteigerte Zugänglichkeit der GPIba Untereinheit des vWF, zurückzuführen ist. Auf Grund unserer Ergebnisse empfehlen wir Blut zur Analyse der vWF-Parameter bei Raumtemperatur und nicht bei 4°C zu lagern, ebenso Blutproben zur Bestimmung nicht auf Eis zu verschicken. Empfehlungen für die Behandlung von Blutproben für die Gerinnungsdiagnostik: Die Blutentnahme soll wegen der möglichen tageszeitlichen Schwankungen zwischen 7.00 Uhr und 9.00 Uhr erfolgen. Eine lange und intensive Venenstauung ist zu vermeiden. Die Blutabnahme sollte mit einer großlumigen Kanüle, unter einem gleichmäßigen und zügigem Bluteinstrom, erfolgen. Bei der Abnahme mehrerer Blutentnahmeröhrchen sollte die Gerinnungsdiagnostik erst als zweites oder drittes Röhrchen entnommen werden, um eine Kontamination mit Gewebsthrombokinase zu vermeiden. Das Gerinnungsröhrchen sollte bis zu Markierung gefüllt sein und anschließend mehrfach geschwenkt werden, um eine gleichmäßige Durchmischung von Antikoagulans und Blut zu gewährleisten (Fiedler et al, 2004). Für eine unmittelbare Untersuchung sollte die Lagerung bei Zimmertemperatur erfolgen, Aufbewahrung im Kühlschrank sollten durch Kälteaktivierung unbedingt vermieden werden, da dies zu Gerinnungszeitveränderungen führen kann. Dies steht im Gegensatz zu den NCCLS-Richtlinien von 1998 (Wayne, 1998), die vorgaben, dass für Gerinnungsanalysen verwendete Proben gekühlt gelagert werden sollten, wenn sie nicht innerhalb von zwei Stunden getestet werden können. Bei einer für einen späteren Zeitpunkt geplanten Untersuchungen sollte Citratplasma portioniert eingefroren werden. Das Auftauen der gefrorenen Proben sollte im Wasserbad bei 37°C erfolgen, wobei auf gründliche Durchmischung und vollständige Lösung eventueller Kryopräzipitate zu achten ist. Die anschließende Untersuchung muß unverzüglich erfolgen, da die Stabilität verschiedener Faktoren nach dem Auftauen herabgesetzt ist (Lutze et al, 1999). Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist nicht zulässig. Die Durchführung der Globaltests sollte maximal vier Stunden nach der Blutentnahme durchgeführt worden sein (Guder et al, 2000; Guder et al, 2002; Narayanan, 2000;Tilsner et al, 1986). Die Bestimmung der Faktor VIII-Aktivität sollte jedoch bis spätestens zwei Stunden nach der Blutentnahme abgeschlossen sein (Lutze et al, 1999; Müller, 1993).
• It is well established that cold promotes a shortening of PT by FXII mediated activation of FVII in whole blood and in plasma (Palmer et al, 1984). Favaloro et al. (2001) found that cold promotes a reduction of the highmolecular vWF-Multimers in samples stored as citrated whole blood at 4°C. However the effect of low temperature on vWF parameters has not been studied in detail. We therefore conducted a study to investigate the preanalytic processing of blood samples on VWF:RCo, VWF:Ag, VWF:CB, APTT and FVIII:C. We collected 90 ml citrated blood from 10 apparently healthy individuals, 10 patients with mild VWD, type 1, 5 patients with VWD, type 2 and 10 patients from a neurochirurgical station. 30 ml of the blood was directly centrifuged (40 min, 4°C and 4000g) and either immediately frozen at 80° C (normally processed) or stored at roomtemperature (RT) or on crashed ice for 3 and 6 hours, respectively. The remaining citrated whole blood was either stored at RT, on crashed ice or between two icedstorage akkus for 3 and 6 hours prior centrifugation and storage at –80°C. Storage on crashed ice or between two iced-storage akkus as citrated whole blood induced in samples from healthy individuals, from patients with VWD, type 1 and from patients from the neurochirurgical station a time dependent decrease of VWF:RCo, VWF:Ag, VWF:CB and FVIII:C and a lengthening of APTT. There was a significant reduction of all investigated parameters (p<0,05, ilcoxonmatchedpairstest) in samples from healthy individuals stored as citrated whole blood on crashed ice or between two iced-storage akkus in all test we have done. In addition we found a significant reduction of VWF:CB in samples were stored as plasma at RT for three hours. FVIII:C was significant reduced under all investigated storage condition except storage of citrated whole blood at RT for three hours. APTT was significant prolonged under all storage conditions. The patients with mild VWD, type 1 demonstrated a significant reductionof all investigated parameters (p<0,05, Wilcoxonmatchedpairstest) in samples stored as citrated whole blood on crashed ice or between two iced-storage. In addition we found a significant reduction of vWF:Ag stored as plasma at RT for three hours and for every storage conditions for APTT and FVIII:C. The patients from the neurochirurgical station showed a significant reduction of (p<0,05, Wilcoxonmatchedpairstest) the samples stored as plasma at RT for three or six hours (VWF:Ag), in samples stored as citrated whole blood on crashed ice for six hours or between two iced-storage akkus for three or six hours (VWF:RCo), in samples stored as citrated whole blood between two icedstorage akkus for six hours (VWF:CB). FVIII:C was significant reduced under all investigated storage condition. APTT was significant prolonged under all storage conditions except storage of citrated whole blood at RT for three hours. Three of the five patients with VWD, type 2 showed in the normally processed sample unmeasurable VWF:RCo (<5%). Storage of citrated whole blood on crashed ice did not induce a significant loss of VWF:Ag, VWF:Rco, FVIII:C, VWF:CB and a lengthening of APTT in these patients with VWD. For patients with VWD, type 2 we did not find any significant change for storage as plasma or as citrated whole blood. We thus suggest that the drastic coldinduced loss of VWF:RCo, VWF:Ag, VWF:CB, FVIII:C and the lengthening of APTT is dependent on the presence of platelets and of HMW:VWF. It is well established, that cold induces an extensive platelet shape change by intracellular cytoskeletal rearrangement (Berger et al, 1998). It has recently been shown that chilling of platelets induces a clustering of the GPIb receptor on the cell surface. (Hoffmeister et al, 2003). We hypothesise that cold-induced loss of VWF in citrated whole blood is due to coldpromoted binding of VWF to platelets probably due to increased susceptibility of GPIba subunit for VWF. Our results demonstrate that blood destined for analysing VWF parameters should be stored at RT rather than at 4°C.