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Jelena Zaitseva

• Nucleotide-binding domains (NBDs), roughly 27 kDa in size, are conservative components of the large family of ABC (ATP-binding cassette) transporters, which includes importers, exporters, and receptors. NBDs or ABC-ATPases supply energy for the translocation of a vast variety of substrates across biological membranes. Despite their hydrophilic sequence, many NBDs tend to aggregate and precipitate in solution upon isolation from the complete transporter. The conditions stabilizing an extremely labile NBD component of the E.coli HlyA transporter, HlyB-NBD, were developed. As a result, the pure highly concentrated enzyme was protected from precipitation for months that allowed screening of the unlimited crystallization conditions in the presence of different substrates and performance of the reproducible functional assays. HlyB-NBD was characterized in regard to its uncoupled ATPase activity, oligomeric state, and stability in solution. Comparative analysis of protein stability and ATPase activity in various buffers suggested an inverse relationship between the two. Kinetic analysis of ATPase activity revealed ATP-induced protein dimerization. Gel-filtration experiments with the wild type protein and H662A-mutant of HlyB-NBD provided further evidence of protein dimerization in the presence of ATP. The crystal structures in post- and pre-hydrolysis nucleotide-bound states of HlyB-NBD were determined at 1.6Å and 2.5Å resolution, respectively. While the hydrolytically deficient H662A mutant of HlyB-NBD was crystallized as a stable dimer in the presence of ATP or ATP-Mg2+, with two nucleotide molecules sandwiched between the two monomers, the same protein was shown to be a monomer in the ADP-loaded state. The wild type protein failed to develop crystals with bound ATP, yet formed ADP-bound crystals identical to those of the H662A-mutant. The X-ray structures of HlyB-NBD in various states of the hydrolytic cycle and the functional studies of the enzyme have provided an opportunity to characterize enzyme-substrate complexes and protein-protein interactions between the NBD subunits in great detail. Comparison of the nucleotide-free, the ADP-, and the ATP-loaded states revealed oligomeric and conformational changes of the protein upon substrate binding and resulted in a molecular picture of the catalytic cycle. The correlated results of the structural and functional investigations of HlyB-NBD are discussed with relation to the mechanism of action of ABC transporters.
• Nukleotid-bindende Domänen (NBDs) sind konservierte Komponenten der großen Familie der ABC (ATP-Bindungskassette) Transporter, die ein Molekulargewicht von ungefähr 27 kDa besitzen. Diese Transporter umfassen Proteine, die als Importer, Exporter oder Rezeptoren fungieren. NBDs oder ABC-ATPasen stellen die Energie für den Transport einer großen Vielzahl unterschiedlicher Substrate über biologische Membranen zur Verfügung. Trotz ihrer hydrophilen Natur besitzen viele isolierte NBDs die Eigenschaft, in Abwesenheit der anderen Komponenten des Transporters in Lösung zu aggregieren und zu präzipitieren. In der hier vorliegenden Arbeit wurden Bedingungen etabliert, die die labile NBD des HlyB Transporters aus E. coli stabilisierten. Die homogene und konzentrierte Enzymlösung wurde dadurch über Monate hinweg gegen Präzipitation geschützt. Dies ermöglichte es, eine große Vielzahl unterschiedlicher Kristallisationsbedingungen in Gegenwart verschiedener Substrate zu analysieren und funktionelle Assays durchzuführen. Die HlyB-NBD wurde bezüglich ihrer basalen ATPase Aktivität, ihres oligomeren Zustandes und ihrer Stabilität in Lösung analysiert, die eine inverse Beziehung zwischen Aktivität und Stabilität implizierte. Kinetische Untersuchungen belegten darüber hinaus eine ATP-induzierte Dimerisierung der NBD. Größenausschlusschromatographie mit dem Wildtyp und der H662A Mutante ergaben weitere Indizien für die ATP-vermittelte Dimerisierung. Die Kristallstrukturen des prä- und post-hydrolytischen Zustandes wurden mit einer Auflösung von 2.5 Å und 1.6 Å bestimmt. Während die H662A Mutante, die keinerlei ATPase Aktivität aufwies, im ATP und ATP/Mg2+ gebundenen Zustand als Dimer mit zwei Nukleotiden an der Interaktionsfläche der beiden Proteinmonomere kristallisiert wurde, bildet die H662A Mutante in Gegenwart von ADP nur Monomer. Für den Wildtyp konnten keine Kristalle in Gegenwart von ATP erhalten werden. Im Gegensatz hierzu war die Struktur im ADP-gebundenen Zustand identisch zur Struktur der H662A Mutante. Die Kristallstrukturen der HlyB-NBD in den unterschiedlichen Zuständen des hydrolytischen Zyklus in Kombination mit funktionalen Untersuchungen in Lösung ermöglichten es, Protein-Substrat und Protein-Protein Wechselwirkungen mit großer Genauigkeit zu bestimmen. Ein Vergleich der Nukleotid-freien, der ADP- und ATP-gebundenen Zustände verdeutlichte, dass sowohl Dimerisierung als auch konformationelle Änderungen durch die Substratbindung erfolgten. Diese Analysen ergaben ein molekulares Bild der essentiellen Schritte des katalytischen Zyklus der HlyB-NBD, die im Zusammenhang mit einem allgemeinen Transportmechanismus von ABC-Transportern diskutiert wurden.