Zusammenfassung

Ziel dieser Arbeit war es zum einen Informationen über den Mechanismus in Dodecinproteinen
zu gewinnen, der zu der effizienten Fluoreszenzlöschung von gebundenem Riboflavin und
einer deutlichen Verlängerung der Lebendsdauer des Chromophors unter Lichteinwirkung
führt. Zum anderen sollte mit Hilfe eines kurzen Modellpeptids, das eine Azobenzoleinheit als
Photoschalter in seinem Peptidrückgrat enthielt, erste Schritte der Peptidfaltung untersucht
werden.
Die Untersuchungen an Dodecinproteinen konzentrierten sich hauptsächlich auf archaeales
Dodecin aus Halobacterium salinarum (HsDod). Eine Besonderheit der Dodecinproteine
ist, dass sie im Gegensatz zu anderen Flavinbindeproteinen zwei Flavinmoleküle in jeder
ihrer sechs identischen Bindetaschen einbauen können. Kurzzeitspektroskopische Untersuchungen
im UV/vis-Spektralbereich zeigen, dass nach Photoanregung eines gebundenen
Riboflavinmoleküls nach etwa 10 ps der Ausgangszustand wieder erreicht wird. Weiterhin
zeigt das Fehlen der stimulierten Emission in den transienten Daten, dass bereits innerhalb
der Zeitauflösung des Experiments, in weniger als 150 fs, der erste angeregte Zustand des
Riboflavins entvölkert wird. Dies verhindert unerwünschte Reaktionen des Riboflavins und
stellt eine Versorgung der Zelle mit diesem wichtigen Baustein für die Biosynthese von
FMN und FAD sicher. Die Ergebnisse zeigen außerdem, dass zwei Spezies mit unterschiedlichen
spektralen Signaturen und Lebensdauern an dem Löschungsmechanismus und der
Wiedererlangung des Ausgangszustands beteiligt sind. Der Vergleich von HsDod-Proteinen in
nicht-deuteriertem und deuteriertem Lösungsmittel sowie die spektrale Signatur der Spezies,
die mit einer Zeitkonstante von etwa 800 fs zerfällt deuten an, dass ein Elektronen- sowie
ein Protonentransfer Teil des Mechanismus sind. Mit Hilfe von HsDod-Proteinen, bei denen
der Asparaginsäurerest unterhalb der Bindetasche, der für das Binden eines wasserkoordinierten
Magnesiumions verantwortlich ist, gegen Serin (D41S) oder Glutaminsäure (D41E)
ausgetauscht war, konnte gezeigt werden, dass das wasserkoordinierte Magnesiumion nicht
relevant für den Löschungsmechanismus ist. Dennoch konnte eine Beteiligung von Wassermolekülen
nicht ausgeschlossen werden. Die Beteiligung eines Elektronentransfers von einem
Tryptophanrest in der Bindetasche auf das photoangeregte Flavin konnte durch Messungen
an Dodecinproteinen mit Tryptophan-Derivaten mit unterschiedlichen Ionisationsenergien
bestätigt werden.
Die Spezies, die mit einer Zeitkonstante von etwa 5 ps zerfällt, die ebenfalls zu einer
Wiederbesetzung des Ausgangszustands führt, konnte nicht eindeutig identifiziert werden.
Die spektrale Signatur des zerfallassoziierten Spektrums könnte neben einer neutralen Tryptophanspezies
und einem kationischen Riboflavinradikal auch durch schwingungsangeregte
Riboflavinmoleküle verursacht werden.
Eine Beteiligung der Ribitylkette am Mechanismus kann aufgrund der Ergebnisse von
HsDod-gebundenem Lumiflavin ausgeschlossen werden. Weiterhin konnte anhand der Ergebnisse
für HsDod-gebundenes FAD, das in seiner geschlossenen Konformation gebunden
wird, wobei der Adeninrest die zweite Position in der Bindetasche besetzt, eine Beteiligung des zweiten Flavins in der Bindetasche am Löschungsmechanismus sowie ein Beitrag zu
den Differenzspektren ausgeschlossen werden. Somit dient die Besetzung einer Bindetasche
mit zwei Flavinmolekülen vermutlich lediglich der Maximierung der Flavinbeladung. Nicht
eindeutig geklärt werden konnte die Frage, ob es sich um einen sequentiellen oder parallelen
Mechanismus handelt.
Neben archaealem wurde auch bakterielles Dodecin mittels transienter UV/vis-Spektroskopie
untersucht. Für Dodecin aus Halorhodospira halophila (HhDod) konnte ebenfalls eine sehr
schnelle Wiedererlangung des Ausgangszustands nach Photoanregung des gebundenen Riboflavins
beobachtet werden. Allerdings spiegeln einige Unterschiede in den transienten Daten
die Unterschiede in den Bindetaschen von archaealem und bakteriellem Dodecin wider und
geben Hinweise darauf, dass die Funktionen in der Zelle für die Dodecine unterschiedlich
sind. Diese Hypothese wird durch verschiedene Cofaktoren, Riboflavin und Lumichrom für
HsDod und FMN für HhDod, in vivo unterstützt. Die ermittelten Zeitkonstanten sind für das
bakterielle Dodecin etwas länger als für das archaeale und die transienten Daten weisen in den
spektralen Signaturen der Differenzsignale sowohl Unterschiede als auch Gemeinsamkeiten
auf.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden erste Schritte der Peptidfaltung mit Hilfe eines
wasserlöslichen bizyklischen Modellpeptids, das den Photoschalter 4(4’-Aminomethylphenylazo)
benzoesäure (AMPB) enthält, untersucht. Hierfür wurden Kurzzeitspektroskopische
Messungen im mittleren infraroten Spektralbereich für den Schaltvorgang von der cis-
Form des Azopeptids in die trans-Form durchgeführt. Diese Methode erlaubt es, transiente
Konformationsänderungen des Peptidrückgrats zu verfolgen. In der cis-Form kann das Peptid
mehrere unterschiedliche Konformationen einnehmen, während der Konformationsraum für
die trans-Form deutlich eingeschränkt ist. Nach der Photoanregung im Bereich der n-pi*-Bande
der Azobenzoleinheit finden die grundlegenden konformationellen Änderungen innerhalb
der ersten 10-20 ps statt. Dies wurde durch polarisationsabhängige Messungen bestätigt.
Auf dieser Zeitskala finden die größten Änderungen in den transienten Differenzspektren
statt, die auf Konformationsänderungen sowie Kühlprozesse zurückzuführen sind. Diese
Prozesse konnten mit einer Zeitkonstanten von 5 ps zusammengefasst werden. Auf längeren
Zeitskalen finden weitere Reorganisationsprozesse statt, die mit einer Zeitkonstante von
300 ps zusammengefasst werden können. Bei maximaler Verzögerungszeit des Experiments
(1,8 ns) ist der Gleichgewichtszustand noch nicht erreicht und es finden weitere Prozesse
auf längeren Zeitskalen statt. Im Vergleich zu einem ähnlichen bereits untersuchten DMSOlöslichen
bizyklischen AMPB-Peptid konnte keine schnellere Dynamik durch den Einsatz von
Wasser als Lösemittel festgestellt werden, wie es vorangegangene transiente Experimente im
UV/vis-Spektralbereich an wasser- und DMSO-löslichen bizyklischen Azopeptiden angedeutet
hatten. Die Ergebnisse der transienten Messungen zeigen gute Übereinstimmungen mit
molekulardynamischen Rechnungen. Das so gewonnene Modell von den Prozessen nach der
Isomerisierung des Photoschalters erlaubt Einblicke in erste Schritte bei der Faltung von
Peptiden in ihrem natürlichen Lösungsmittel Wasser und die Zeitskalen der entsprechenden
Prozesse.