Open Access

Bithiah Grace Jaganthan

• Stem cells capable of self-renewal and differentiation into multiple tissues are important in medicine to reconstitute the hematopoietic system after myelo-ablative chemo- or radiotherapy. In the present situation, adult stem cells such as Mesenchymal stem cells (MSC) and Hematopoietic stem cells (HSC) are used for therapeutic purposes. For tissue regeneration and tissue constitution, engraftment of transplanted stem cells is a necessary feature. However, in many instances, the transplanted stem cells reach the tissues with low efficiency. Considering the three-step model of leukocyte extravasation by Springer et al, the rolling, adhesion and transmigration form the three major steps for the transplanted stem cells to enter the desired tissues. One of the molecular switches reported to be involved in these mechanisms are the Rho family GTPases. The present study investigates the role of Rho GTPases in adhesion and migration of stem and progenitor cells. Chemotactic and chemokinetic migration assays, transendothelial migration assays, migration of cells under shear stress, microinjection, retroviral and lentiviral gene transfer methods, oligonucleotide microarray analysis and pull down assays were employed in this study for the elucidation of Rho GTPase involvement in migration and adhesion of stem and progenitor cells. The transmigration assay used for the migration determination of the adherent cell type, MSC, was optimized for the efficient and effective assessment of the migrating cells. The involvement of Rho was found to be critical for stem and progenitor cell migration where inactivation of Rho by C2I-C3 transferase toxin and/or overexpression of C3 transferase cDNA increased the migration rate of Hematopoietic progenitor cells (HPC) and MSC. Moreover, modulation of Rho caused predictable cytoskeletal and morphological changes in MSC. Assessment of Rho GTPase involvement in the interacting partner, the endothelial cells during stem cell migration, revealed that active Rho expression induced E-selectin expression. The increased levels of E-selectin were functionally confirmed by the increased adhesion of progenitor cells (HPC) to the Human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) layer. Moreover, inhibition of Rac in the migrating endothelial progenitor cells (eEPC) increased their adhesion to HUVEC correlating with the increased percentage expression of cell surface receptor, CD44 in Rac inactivated eEPC. In conclusion, this study shows that Rho GTPases control the adhesion and migration of stem and progenitor cells, HPC and MSC. Rho inhibition drives the cells to migrate in the blood vessels. The substantial increase in the level of active Rho in endothelial layer, manifested by the E-selectin surface expression assists the better adhesion of stem and progenitor cells to the endothelial layer. Serum factors and growth factors in the physiological system influence the Rho GTPase expression in both migrating stem cells and the barrier endothelial cells. Thus, specific modulation of Rho GTPases in the transplanted stem and progenitor cells could be an interesting tool to improve the migration and homing processes of stem cells for cellular therapy in future.
• Stammzellen zeichnen sich durch die Fähigkeit zu Selbst-Erneuerung und Differenzierbarkeit in unterschiedliche Gewebe aus. Dies macht sie zur Anwendung in der Medizin attraktiv. Gegenwärtig werden adulte Stammzellen wie mesenchymale Stammzellen (MSC) und hämatopoietische Stammzellen (HSC) zu therapeutischen Zwecken transplantiert. Mesenchymale Stammzellen werden seit einigen Jahren als interessantes Mittel zur Organregeneration z.B. des Herzens diskutiert, während hämatopoietische Stammzellen medizinisch zur Rekonstitution des hämatopoietischen Systems nach myeloablativer Therapie eingesetzt werden. Notwendig ist hierbei das Anwachsen der transplantierten Stammzellen im Empfänger; in vielen Fällen aber geschieht dies nur mit sehr geringer Effizienz. In diesem Zusammenhang interessant ist die Anwendung des dreischrittigen Modells von Springer et al. für die Auswanderung von Leukozyten aus den Blutgefäßen ins Gewebe auf Stammzellen, das Rolling, Adhäsion und Transmigration von Zellen als die entscheidenden Schritte beschreibt. Nach der Transplantation, die in der Regel in den Blutkreislauf erfolgt, wandern Stammzellen selbständig in die Blut bildenden Organe ein, die ihr eigentliches "Zuhause" im Körper sind. Ein wichtiger molekularer Schalter bei diesen "homing"-Mechanismen sind die so genannten Rho-GTPasen (ras-homologe Guanosin-Triphosphatasen). Die vorliegende Arbeit untersucht die Bedeutung der Rho-GTPasen für die Adhäsion und Migration von Stamm- und Vorläuferzellen. Durch die Analyse der chemotaktischen und chemokinetischen Migration, transendothelialer Migration, Migration von Zellen unter Scher-Stress, Mikroinjektion, retrovirale und lentivirale Gentransfermethoden, Oligonukleotid-Mikroarrays und Pull-Down-Assay wurde versucht, die Rolle von Rho-GTPasen bei der Migration und Adhaesion von Stamm- und Vorlaeuferzellen aufzuklaeren. Die Versuchsbedingungen für Migrationsexperimente mit MSC - adhärenten Stammzellen - wurden zunächst optimiert, um das Wanderungsverhalten der Zellen effektiv erfassen und darstellen zu können. Die Bedeutung von Rho für die Migration von Stamm- und Vorläuferzellen zeigte sich, als die Inaktivierung von Rho durch C2I-C3-Transferase-Toxin und/oder Ueberexpression von C3-Transferase-cDNA in den Migrationsexperimenten überraschenderweise die chemokinetische Migration von HPC und MSC signifikant erhöhte. Außerdem bewirkte eine Modulation von Rho durch Expression dominant-negativer bzw. konstitutiv-aktiver Varianten deutliche Veränderungen in der Morphologie und im Zytoskelett von MSC. Die Analyse der Rho-GTPasen in Endothel-Zellen als den interagierenden Partnern der Stammzellen während ihrer Migration aus den Blutgefäßen in die Gewebe zeigte, dass eine erhöhte Rho-Expression mit einer erhöhten E-Selektin-Expression korrelierte. Die erhöhte E-Selektin-Expression im Endothel konnte funktionell bestätigt werden durch eine erhöhte Adhäsion von Vorläuferzellen an das Endothel. Nicht zuletzt erhöhte die Inhibition von Rac in migrierenden endothelialen Vorläuferzellen (eEPC) deren Adhäsion an HUVEC, korrelierend mit der erhöhten Expression des E-Selektin-Liganden CD44 in diesen Zellen. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit, dass Rho-GTPasen die Adhäsion und Migration von Stamm- und Vorläuferzellen regulieren. Inhibiton von Rho führt zu erhöhter Mobilisation dieser Zellen in den Blutkreislauf. Die Zunahme der aktiven Form von Rho in den Zellen des Endothels, die sich in erhöhter E-Selektin-Expression auf den Zellen manifestiert, führt zu einer Erhöhung der Adhäsion von Stamm- und Vorläuferzellen an das Endothel. Wachstumsfaktoren und Faktoren im Serum beeinflussen die Expression von Rho-GTPasen sowohl in zirkulierenden Stammzellen als auch im Endothel. Deshalb könnte eine spezifische Regulation der Rho-GTPasen in transplantierten Stamm- und Vorläuferzellen ein wichtiges Mittel zur Verbesserung der Transplantationseffizienz und damit der Stammzelltherapie insgesamt sein.