Open Access

Martynas Gavutis

• Protein-protein interactions within the plane of cellular membranes play a key role for many biological processes and in particular for transmembrane signaling. A prominent example is the ligand-induced crosslinking of cytokine receptors, where 3- dimensional cytokine binding followed by 2-dimensional interaction between the receptor subunits have been recognized to be important for regulating signaling specificity. The fundamental importance of such coupled interactions for cell-surface receptor activation has stimulated numerous theoretical studies, which have hardly been confirmed experimentally. An experimental approach to measure interactions and real time kinetics of type I interferon (IFN) induced assembly between interferon receptor subunits ifnar2 and ifnar1 on membrane was developed and determinants of the 2-dimensional interactions, such as dimensionality, size, valency, orientation, membrane fluidity and receptor density were quantitatively addressed The C-terminal decahistidine tagged extracellular domains (EC) of ifnar1 and ifnar2 were site- specifically tethered onto solid-supported fluid lipid membrane, which carried covalently attached chelator bis-nitrilotriacetic acid (bis-NTA) groups. Interactions on the lipid bilayer were detected with a novel solid phase detection technique, which allows simultaneous detection of ligand binding to a membrane anchored receptors and lateral interaction between them in the real time. This was achieved by combining two optical techniques: label-free reflectance interferometry (RIf) and total internal reflection fluorescence spectroscopy (TIRFS). Fluorescence signals, in the order of 10 fluorophores/µm2, were detected without substantial photobleaching. The sensitivity of the label-free interferometric detection was in the range of 10 pg/mm2. The crosstalk between the two signals was eliminated by means of spectral separation. Fluorescence was detected in the visible region and RIf was performed at 800 nm in the near infrared. Flow through conditions allowed to automate experiments and measure binding events as fast as ~ 5 s-1. Using this technique we have dissected the interactions involved in IFN-induced ifnar crosslinking. 2-dimensional association and dissociation rate constants were independently determined by tethering high stoichiometric excess of one of the receptor subunits and comparing dissociation of the labelled ligand away from the membrane in the absence and presence of the non-labelled high affinity competitor. Dissociation traces were fitted with the two-step dissociation model: the first step being the 2-dimensional separation of the ternary complex followed by the 3- dimensional ligand dissociation into solution. Label-free RIf detection allowed absolute parameterization of the 2-dimensional concentrations of the ifnar subunits on the membrane. The TIRFS signal provided high sensitivity of the ligand dissociation and was correlated against the RIf signal before fitting. These features of the detection system allowed us to parameterize the model, and the 2-dimensional association or dissociation rate constants were the only variables during the fitting. Another FRET based binding assay was developed to determine the 2- dimensional dissociation rate constant using a pulse-chase approach. The donor fluorescence from ifnar2-EC was quenched upon the ternary complex formation with the acceptor-labelled IFN and the nonlabelled ifnar1-EC. The equilibrium was perturbed by rapid tethering of substantial excess of the nonlabelled ifnar2-EC onto the membrane. The exchange of the labelled ifnar2-EC with the nonlabelled one was monitored as the decrease in the FRET signal with the 2-dimensional dissociation of ifnar2-EC from the ternary complex being the rate limiting step. Based on the several mutants and variants of the interacting proteins, the effect of different rate constants and receptor orientation on the 2-dimensional crosslinking dynamics was studied. We have identified several critical features of the 2- dimensional interactions on membranes, which cannot be readily concluded from the solution binding assays. The restricted rotation and the increased lifetime of the encounter complex due to high membrane viscosity are the main determinants of the 2-dimensional association. Tethering ifnar1-EC to the membrane via N-terminal decahistidine tag decreased the 2-dimensional association rate constant 4-5 fold. Electrostatic attraction and steering, the important mechanism to enhance association rate constant between the soluble proteins, are not pronounced for interactions on the membrane. Protein orientation due to membrane anchoring dominates over electrostatic effects and together with the increased lifetime of the encounter complex consequence that 2-dimensional association rate constants are quite similar and do not correlate with association rate constants in solution. The 2- dimensional dissociation rate constants were generally 2-5-fold lower compared to the corresponding 3-dimensional dissociation rate constants in solution. Possible explanations for this are that long lifetime of the encounter complex stabilizes the ternary complex or that membrane tethering affects the interaction diagram. In conclusion, combined TIRFS-RIf detection turn to be powerful and versatile technique to characterize protein-protein interactions on membranes.
• Inter-zelluläre Kommunikation basiert häufig auf Liganden, welche selektiv von Rezeptoren auf der Plasmamembran erkannt werden, und durch Wechselwirkung mit diesen Rezeptoren Signaltransduktion im Zytoplasma aktivieren. Die molekularen Mechanismen der Signalvermittlung durch die Membran sind noch wenig verstanden. Die wichtigen Klassen der Zytokinrezeptoren und der Rezeptortyrosinkinasen werden durch Liganden aktiviert, die zu einer Di- oder Oligomerisierung von Rezeptoruntereinheiten führt, welche offenbar für die Aktivierung zytoplasmatischer Effektoren notwendig ist. Diese laterale Interaktion zwischen Rezeptoruntereinheiten lässt sich aus mehreren Gründen nicht mit der Interaktion der Proteine in Lösung vergleichen. Zum einen handelt es sich um eine Wechselwirkung in 2 anstatt von 3 Dimensionen, d.h. die Interaktionspartner haben durch die Verankerung auf der Membrane weniger Freiheitsgrade als in Lösung. Dabei spielt die eingeschränkte Rotation ein besondere Rolle, da sie zu einer Vor-Orientierung der Interaktionspartner führt. Ein weiterer wichtiger Unterschied ist die dramatisch langsamere Diffusion von Membran-verankerten Proteinen im Vergleich zu Proteinen in Lösung. Über die Einflüsse dieser Faktoren auf die Bildung von Proteinkomplexen an der Membran wurde sehr viel spekuliert, aber es liegen bis dato kaum systematische experimentelle Untersuchungen vor. In der vorliegenden Arbeit sollten Detektionsmethoden und Bindungsassays etabliert werden, mit welchen die Gleichgewichtskonstanten und die Ratenkonstanten von Ligand-Rezeptor Interaktionen auf Membranen in vitro bestimmt werden können. Als biologisches Testsystem wurde der Typ I Interferonrezeptor gewählt. Typ I Interferone (IFN) sind wichtige Zytokine in der angeborenen Immunabwehr von viralen Infektionen, und haben weitere wichtige Funktionen für die Aktivierung des adaptiven Immunsystems. Interessanterweise binden verschiedene IFN an den gleichen Rezeptor, aber führen zu unterschiedlichen Wirkungsmustern. Diese Unterschiede müssen in der Wechselwirkung mit den Rezeptoruntereinheiten ifnar1 und ifnar2 kodiert sein. Intensive Struktur-Funktions-Untersuchungen konnten keine Unterschiede in der Struktur oder Stöchiometrie der Ligand-Rezeptor Komplexen identifizieren, die durch verschiedene IFN rekrutiert werden. Allerdings unterscheiden sich für verschiedene IFN die Bindungskonstanten und die Ratenkonstanten der Wechselwirkung mit den Rezeptoruntereinheiten außerordentlich. Daher sind vermutlich die Effinzienz der Rekrutierung der Rezeptoruntereinheiten und die Dynamik des ternären Komplexes von zentraler Bedeutung für die differentielle Wirkung verschiedener IFN. Da der Ligand die beiden Untereinheiten auf der Membran verbrückt, sind hier 2- dimensionale Wechselwirkungen Membran-verankerter Proteine vermutlich die Grundlage unterschiedlicher Wirkung. Um diese Szenario zu emulieren, wurden die extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) über Cterminale Histidin-tags an Festkörper-unterstützten Membranen mit Chelatorlipiden angebunden. FRAP-Experimente haben gezeigt, dass die so angebundenen Proteine lateral mit einer Geschwindigkeit von ca. 1 µm²/s diffundieren, also ähnlich der (lokalen) Diffusion auf der Plasmamembran. Zur Untersuchung der Ligand-induzierten Hetero-Dimerisierung von ifnar1-EC und ifnar2-EC auf Festkörper-unterstützten Membranen wurde ein Versuchsaufbau zur simultanen Detektion von Fluoreszenz und von Massenänderungen an Oberflächen implementiert. Dazu wurde die totalinterne Reflexions-Fluoreszenz Spektroskopie (TIRFS) mit der reflektometrischen Interferenzspektroskopie (RIf) kombiniert. TIRFS basiert auf der selektiven Anregung von Oberflächen-nahen Fluorophoren durch das evaneszente Feld, welches bei Totalreflexion an Grenzflächen wenige 100 nm mit dem benachbarten Medium wechselwirkt. Über Faseroptik wurde zusätzlich eine Illuminierung senkrecht zur Transducer-Oberfläche implementiert, über welche die Dicke einer Interferenzschicht reflektometrisch gemessen werden kann. Durch diese Methode können Bindungsereignisse an Oberflächen markierungsfrei quantifiziert werden. Da die Schichtdickenmessung bei 800 nm im NIR Bereich erfolgt, ist sie von der Fluoreszenzmessung im sichtbaren Bereich (500-700 nm) spektral separiert. Die Detektion von Fluoreszenz- und Massenänderungen an der Oberfläche wurde über die Fusion von Vesikeln mit Fluoreszenzmarkierten Lipiden charakterisiert. So konnte gezeigt werden, dass in der Tat beide Signale voneinander unabhängig voneinander und ohne detektierbares Übersprechen detektiert wurden. Das massensensitive Interferenzsignal wurde mittels Vesikelfusion kalibriert, da die dabei entstehende Lipiddoppelschicht eine definierte, reproduzierbare Masse auf der Oberfläche abscheidet. Für die massensensitive Interferenzdetektion ergab sich so ein Detektionslimit von etwa 10 pg/mm². Mittels Fluoreszenzdetektion konnten Oberflächenbeladungen von wenigen Molekülen/µm² detektiert werden. Durch Kombination mit einer automatisierten Fluidik konnten schnelle Injektionsschemata realisiert werden, so dass Ratenkonstanten von bis zu 5 s-1 aufgelöst werden konnten. Diese kombinierte Detektionsmethode wurde zunächst eingesetzt, um die einzelnen Interaktionen von Fluoreszenz-markiertem IFNα2 sowie anderen IFN mit ifnar1-EC bzw. ifnar2-EC zu charakterisieren. So konnten die Ratenkonstanten dieser Interaktionen bei sehr geringen Oberflächenkonzentrationen charakterisiert werden, was für eine genaue Bestimmung ohne Einfluss von Massentransport- Effekten notwendig ist. Durch simultane Detektion der Bindung über das Massensignal und das Fluoreszenzsignal wurde die Orts-spezifische Fluoreszenzmarkierung des Liganden IFNα2 untersucht, und gezeigt, dass die Bindung an die Rezeptoruntereinheiten durch die Fluoreszenzmarkierung nicht beeinflusst wurde. Zudem konnte kompetitive Bindung von IFN nicht nur an die hochaffine Untereinheit ifnar2, sondern auch an ifnar1, welche IFN nur mit sehr geringer Affinität erkennt, gezeigt werden. Im nächsten Schritt wurde die Ligand-induzierte Assemblierung des ternären Komplexes mit ifnar1-EC und ifnar2-EC auf fluiden Membranen untersucht. Dabei wurde bei hohen Rezeptorbeladungen sehr langsame Dissoziation des Liganden beobachtet, die bei niedrigen Rezeptorbeladungen deutlich schneller war. Diese Beobachtung deutete auf eine kinetische Stabilisierung des ternären Komplexes hin. Über Chasing-Experimente mit unmarkiertem Liganden konnte diese Vermutung bestätigt werden, da ein deutlich beschleunigter Austausch des Liganden beobachtet wurde. Da über das RIf-Signal die absoluten Oberflächenkonzentrationen von ifnar1-EC und ifnar2-EC bestimmt werden konnten, wurde so auch eine strikte 1:1:1 Stöchiometrie des ternären Komplexes gezeigt: war eine der Untereinheiten im Überschuss, dissozierte der überschüssige Ligand zunächst mit einer Kinetik, die dem entsprechenden 1:1-Komplex entsprach, bis sich ein stabiler 1:1:1-Komplex gebildet hatte. Die Bildung des ternären Komplexes wurde im Folgenden detailliert charakterisiert. Zunächst wurde die Dissoziationskinetik bei verschiedenen Oberflächenkonzentrationen der Rezeptoruntereinheiten in stöchiometrischem Verhältnis vermessen. Diese Kurven konnten durch ein 2-stufiges Assoziations- bzw. Dissoziationsmodell angepasst werden, in dem der Ligand im ersten Schritt an ifnar2-EC bindet und im zweiten Schritt mit ifnar1 auf der Membran einen ternären Komplex bildet. Dadurch, dass die Oberflächenkonzentrationen von ifnar1-EC und ifnar2-EC genau quantifiziert werden konnten, musste nur ein Parameter in diesem Modell angepasst werden, welcher der Gleichgewichts-Dissoziationskonstante der 2- dimensionalen Interaktion des binären IFN/ifnar2-EC Komplexes mit ifnar1-EC beschreibt. Aus allen Experimenten mit Oberflächenbeladungen, die über einen Konzentrationsbereich von zwei Größenordnungen variierte, konnte reproduzierbar eine Bindungskonstante von ca. 40 Molekülen/µm² bestimmt werden. Erstaunlicherweise liegt diese Bindungskonstante deutlich über der typischen Konzentration von Rezeptoren auf der Zelloberfläche (ca. 1000/Zelle). Damit ist es wahrscheinlich, dass die Bildung des ternären Komplexes auf der Zelloberfläche durch die Bindungsaffinität bzw. die Rezeptorkonzentration limitiert ist. Diese Affinität lässt sich nicht durch Steigerung der Dosis kompensieren. Interessanterweise gibt es zudem IFN mit deutlich höherer Affinität zu ifnar1. Damit könnte diese Interaktion eine Schlüsselrolle bei der Regulation des Ansprechverhaltens verschiedener Zellen spielen. Weitere Untersuchungen zur Bildung des ternären Komplexes wurden mit IFNα2 Mutanten durchgeführt, welche eine niedrigere Bindungsaffinität zu ifnar2-EC zeigten. Die Dissoziationskinetiken dieser Mutanten aus dem ternären Komplex mit ifnar1-EC und ifnar2-EC ergaben, dass selbst bei stöchiometrischen Konzentrationen der Rezeptoruntereinheiten durchaus auch die Bindung an ifnar1 im ersten Schritt erfolgen kann. Da die Ligandenbindung der Geschwindingkeits-bestimmende Schritte der Rezeptorassembliert darstellt, entscheidet die relative Assoziationswahrscheinlichkeit, inwieweit welcher dieser beiden Wege populiert ist. Damit ist nicht nur die Assoziationsratenkonstante, sondern auch die relative Konzentration der Rezeptoruntereinheiten für den Assemblierungsmechanismus wichtig. Da unterschiedliche IFN verschiedene Assoziationsratenkonstanten haben, sind durchaus verschiedene Assemblierungssmechanismen für verschiedene IFN denkbar. Um die Dynamik des ternären Ligand-Rezeptor-Komplexes auf der Membran zu charakterisieren wurden Assays etabliert, um die 2-dimensionale Interaktionskinetik direkt zu messen. Hier wurden zwei Strategien verfolgt. Zunächst wurde der Förster- Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen Donor-markiertem ifnar2-EC und Akzeptor-markiertem ifnar1-EC eingesetzt, um die Ligand-Rezeptor Interaktion auf der Membran zu verfolgen. Durch schnelles Beladen mit einem Überschuss von unmarkiertem ifnar2-EC auf die Membran wurde ein Austausch von markiertem gegen unmarkierten ifnar2-EC über das Abklingen des FRET gemessen. Dieser Austausch wird bestimmt durch die 2-dimensionale Dissoziazionskinetik des ifnar2- EC/IFNα2 Komplexes die aus der Änderung des FRET-Signals bestimmt werden kann. Interessanterweise war die Dissoziationsratenkonstante, die aus dieser Kinetik bestimmt wurde, um einen Faktor 3-5 höher als die Dissoziationsratenkonstante des ifnar2-EC/IFNα2 Komplexes mit dem freien Liganden. Da die Bindung von ifnar1-EC keinen Einfluss auf die ifnar2-EC/IFNα2 Interaktion hat, müssen diese Unterschiede auf die Verankerung an der Membran zurückgeführt werden. Wahrscheinlich spielt die langsamere Diffusionskinetik hier eine entscheidende Rolle, die zu einer langsameren Separation der dissoziierten Komponenten führt. Diese Beobachtungen wurden bestätigt durch Bindungsassays, in denen die Austauschkinetik des Liganden im ternären Komplex bei Zugabe von unmarkiertem Liganden vermessen wurde. Dazu wurde eine der Rezeptoruntereinheiten im stöchiometrischen Überschuss auf die Membran geladen. Nach Bildung des ternären Komplexes mit Fluoreszenz-markiertem IFNα2 wurde der Überschuss an Rezeptoruntereinheit mit unmarkiertem Liganden in hoher Konzentration beladen. Der nun erfolgende Austausch von markiertem gegen unmarkierten Liganden wurde über das Fluoreszenzsignal verfolgt. Bei Verwendung geeigneter Mutanten ist diese Austauschkinetik wiederum durch die 2-dimensionale Dissoziationskinetik der Ligand-Rezeptor-Interaktion bestimmt. Mit diesen Bindungsassays wurden die Dissoziationskinetiken für ifnar1-EC und ifnar2-EC, sowie verschiedene Mutanten bestimmt. Aus der Gleichgewichts-Dissoziationskonstante und der Dissoziationsratenkonstante konnte auch die 2-dimensionale Assoziationsratenkonstante berechnet werden. Basierend auf systematischen Untersuchungen konnten einige prinzipielle Eigenschaften von 2-dimensionalen Protein-Protein Interaktionen identifiziert werden. So bestätigte sich für alle Ligand- Rezeptor Interaktionspaare, dass die 2-dimensionale Dissoziationskinetik um einen Faktor 3-5 langsamer war als die entsprechende 3-dimensionale Dissoziation. Weiterhin ist konnte für die Assoziationskinetik beobachtet werden, dass die großen Unterschiede in der Assoziationsratenkonstante in Lösung, die durch elektrostatisches Wechselwirkungen zu erklären sind (electrostatic steering), nicht für die 2-dimensionale Interaktion auf der Membran beobachtet wurde. Weit wichtiger als elektrostatische Steuerung ist dagegen die „richtige“ Orientierung der Proteine an der Oberfläche: Durch Änderung der Orientierung von ifnar1-EC auf der Membran über ein N-terminales Histidin-tag sank die Assoziationratenkonstante um einen Faktor von >5. Dies ist insbesondere überraschend, weil ifnar1-EC eine flexible multi- Domänenstruktur hat und zudem relativ flexibel über das Histidin-tag an der Membrane angebunden ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Membranverankerung, die Flexibilität, die laterale Diffusionskinetik und die Oberflächenkonzentration zentrale Parameter für die Bildung und die Dynamik Zytokin-Rezeptorkomplexen auf Membranen sind. Diese Eigenschaften hängen auch von der lokalen Umgebung auf der Plasmamembran ab, die sich auch durch die Komplexbildung ändern können. Damit lässt sich erwarten, dass Rezeptorassemblierung in Zellen einen noch durchaus komplexeren Verlauf nehmen kann. In dieser Arbeit konnten diese Prozesse unter kontrollierten Bedingungen charakterisiert werden. Dabei erwies sich die neu etablierte Methode der simultanen TIRFS-RIf Detektion als äußerst versatil. Die komplementären Messgrößen dieser Detektionsmethode waren insbesondere nützlich, um die multiplen Parameter (Membran-Assemblierung, Rezeptorkonzentrationen) zu kontrollieren, und gleichzeitig komplexe Bindungsassays mit hoher Zeitauflösung durchzuführen. Eine breite Anwendung dieser Methode, um komplexe Prozesse an Membranen und an nicht-fluiden Oberflächen zu charakterisieren, ist vorauszusehen.