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Albina Abdrakhmanova

• Mitochondial NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) the largest multiprotein enzyme of the respiratory chain, catalyses the transfer of two electrons from NADH to ubiquinone, coupled to the translocation of four protons across the membrane. In addition to the 14 strictly conserved central subunits it contains a variable number of accessory subunits. At present, the best characterized enzyme is complex I from bovine heart with a molecular mass of about 980 kDa and 32 accessory proteins. In this study, the subunit composition of mitochondrial complex I from the aerobic yeast Y. lipolytica has been analysed by a combination of proteomic and genomic approaches. The sequences of 37 complex I subunits were identified. The sum of their individual molecular masses (about 930 kDa) was consistent with the native molecular weight of approximately 900 kDa for Y. lipolytica complex I obtained by BN-PAGE. A genomic analysis with Y. lipolytica and other eukaryotic databases to search for homologues of complex I subunits revealed 31 conserved proteins among the examined species. A novel protein named “X” was found in purified Y. lipolytica complex I by MALDI-MS. This protein exhibits homology to the thiosulfate sulfurtransferase enzyme referred to as rhodanese. The finding of a rhodanese-like protein in isolated complex I of Y. lipolytica allows to assume a special regulatory mechanism of complex I activity through control of the status of its iron-sulfur clusters. The second part of this study was aimed at investigating the possible role of one of these extra subunits, 39 kDa (NUEM) subunit which is related to the SDRs-enzyme family. The members of this family function in different redox and isomerization reactions and contain a conserved NAD(P)H-binding site. It was proposed that the 39 kDa subunit may be involved in a biosynthetic pathway, but the role of this subunit in complex I is unknown. In contrast to the situation in N. crassa, deletion of the 39 kDa encoding gene in Y. lipolytica led to the absence of fully assembled complex I. This result might indicate a different pathway of complex I assembly in both organisms. Several site-directed mutations were generated in the nucleotide binding motif. These had either no effect on enzyme activity and NADPH binding, or prevented complex I assembly. Mutations of arginine-65 that is located at the end of the second b-strand and responsible for selective interaction with the 2’-phosphate group of NADPH retained complex I activity in mitochondrial membranes but the affinity for the cofactor was markedly decreased. Purification of complex I from mutants resulted in decrease or loss of ubiquinone reductase activity. It is very likely that replacement of R65 not only led to a decrease in affinity for NADPH but also caused instability of the enzyme due to steric changes in the 39 kDa subunit. These data indicate that NADPH bound to the 39 kDa subunit (NUEM) is not essential for complex I activity, but probably involved in complex I assembly in Y. lipolytica.
• Die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I) ist das größte und komplizierteste Enzym der Atmungskette, es katalysiert den Transfer von zwei Elektronen von NADH auf Ubichinon. Daran gekoppelt ist die Translokation von vier Protonen über die innere Membran. Die 14 sogenannten zentralen Untereinheiten, die auch im bakteriellen Komplex I vorkommen, bilden die "minimale" Form des Enzyms. Sieben davon befinden sich im peripheren Arm und sind kernkodiert. Der Membranarm enthält weitere sieben Untereinheiten, die hydrophob sind und von mitochondrialer DNA kodiert werden. Der eukaryotische Komplex I besitzt zusätzlich zu den 14 zentralen Untereinheiten noch 23-32 "akzessorische" Untereinheiten. Komplex I aus Rind hat ein Molekulargewicht von etwa 1 MDa und besteht aus 46 Untereinheiten (Carroll et al., 2003). Die Funktion der meisten akzessorischen Untereinheiten ist unbekannt. Das erste Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der Untereinheiten, aus denen sich Komplex I von obligat aerobe Hefe Y. lipolytica, die als Modellsystem für strukturelle und funktionelle Untersuchungen an Komplex I etabliert wurde, zusammensetzt. Der isolierte Komplex I wurde mithilfe von dSDS-PAGE (Rais et al., 2004) in einzelne Untereinheiten zerlegt. 39 Proteinspots wurden im Gelmuster separiert, davon wurden 23 Untereinheiten mittels MALDI-MS identifiziert, inklusive der sieben zentralen kernkodierten Untereinheiten. Durch die Kombination von proteinbiochemischen und genomanalytischen Methoden sind insgesamt 37 Untereinheiten von Komplex I aus Y. lypolytica identifiziert worden. Die Summe ihrer individuellen molekularen Massen (zirka 930 kDa) stimmt gut überein mit der molekularen Masse von ungefähr 900 kDa für Y. lipolytica Komplex I, die mithilfe von BN-PAGE bestimmt wurde. Detaillierte Analyse der Proteinsequenz der NUWM Untereinheit, die vorher als organismusspezifisches Protein bezeichnet wurde (Abdrakhmanova et al., 2004), zeigte jedoch, dass diese Untereinheit Homologie zur NESM Untereinheit aus Rind aufweist. Ein neues Protein "X" wurde in gereinigtem Y. lipolytica Komplex I mithilfe von MALDI-MS identifiziert. Kein Homolog konnte in Komplex I von anderen eukaryotischen Organismen gefunden werden. Dieses Protein zeigt aber eindeutige Homologie zu Mitgliedern der Thiosulfat Sulfurtransferase Enzymfamilie. Die Identifizierung eines möglichen Sulfurtransferase-Proteins im gereinigten Y. lipolytica Komplex I könnte ein Hinweis darauf sein, dass Y. lipolytica einen regulatorischen Mechanismus für Atmungsketten Komplexe besitzt, der über den Status ihrer Eisen-Schwefel Cluster wirkt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Funktion der akzessorischen 39-kDa Untereinheit untersucht. Diese Untereinheit gehört zu der short-chain reduktase/dehydrogenase Enzymfamilie und kann NADPH als Kofaktor binden. Jedoch ist nicht klar, ob das NADPH ein austauschbares Substrat darstellt oder ob es fest an das Protein gebunden ist und für die Strukturstabilität des Proteins erforderlich ist. Im Gegensatz zu N. crassa lieferte die Deletion der 39-kDa Untereinheit in Y. lipolytica keinen assemblierten Komplex I. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass N. crassa und Y. lipolytica möglicherweise verschiedene Assemblierungswege des Komplex I haben. Es wurde eine Reihe von Punktmutationen in die 39-kDa Untereinheit eingeführt. Die Punkmutationen wurden direkt in der Nukleotidbindunsstelle (GXXGXXG) (G43) und an der Position des basischen Restes am Ende des zweiten -Strangs, der für die selektive Bindung von NADPH verantwortlich ist (R65), generiert. Der Gehalt des Enzyms in der mitochondrialen Membran der G43A Mutante war auf 50 % reduziert, bei unveränderter Aktivität. Auch das molare Verhältnis von NADPH zu Komplex I beträgt in der G43A Mutante nur 40 %. Ausgehend der Annahme eines austauschbaren NADPH kann spekuliert werden, dass das NADPH der 39-kDa Untereinheit an einem biosynthetischen Prozess beteiligt ist, welcher ein Produkt liefert, das für die Komplex I Assemblierung erforderlich ist. Die Tatsache, dass die G43A Mutante bei partiellem Verlust des Kofaktors wildtypische Aktivität besaß, zeigt an, dass diese Untereinheit vermutlich nicht für die Komplex I Aktivität notwendig ist. Nach dem Austausch G43V konnten mithilfe der Western-Blot Analyse nur Spuren des Enzyms in Zellen identifiziert werden, die bei niedriger Temperatur angezogen wurden. Mutationen des Arginin-65 lieferte in den mitochondrialen Membranen einen assemblierten und aktiven Komplex I. Jedoch war die Menge des Kofaktors in den Mutanten im Vergleich zum Elternstamm geringer. Die Reinigung des Komplexes I aus den Mutanten führte zu einer starken Reduzierung der Ubichinon-Reduktase Aktivität. Vermutlich führte der Austausch von Arginin-65 nicht nur zur Abnahme der Affinität des Protein für NADPH, sondern auch zu Instabilität aufgrund von strukturellen Änderungen des Proteins.