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Luana Licata

• Calcium-activated potassium channels are fundamental regulators of neuron excitability. SK channels are activated by an intracellular increase of Ca++ (such as occurs during an action potential). They have a small single channel conductance (less than 20pS) and show no voltage dependence of activation. To date, there are only a few examples of high-resolution structures of eukaryotic membrane proteins. All of them were purified from natural sources. Since no abundant natural sources of eukaryotic K+ channels are available we overexpressed rSK2 in order to produce the quantities necessary for structural analysis. Unfortunately the Pichia pastoris expression system did not yield sufficient amount of pure protein, mainly because most of the protein was retained by in the ER and was only partially soluble. Subsequently, two constructs were expressed: SK2-FCYENE (containing a specific sequence that promotes surface expression), and SK2-q-CaM a concatamer of SK2 and calmodulin. Although these proved an improvement in terms of solubilisation, little improvement was found in terms of amounts of purified material obtained. For this reason we tested the Semliki Forest virus expression system, since the protein is expressed in a mammalian system where we hoped that it would be trafficked in the same way as in vivo. Using this system it was possible to express rSK2 and solubilise it with several detergents and to achieve much better purification. However, the levels were still not sufficient for high-resolution structural studies, although sufficient for single particle electron microscopy analysis.
• Kaliumkanäle vermitteln als reguliertes Porenprotein den selektiven Transport von Kaliumionen durch die Zellmembran. Sie sind für physiologische Prozesse wie Neurosekretion und Tonus der glatten Muskulatur von Bedeutung. Eine Familie stellen die Calcium-aktivierten Kaliumkanäle dar, welche wiederum in drei Unterfamilien aufgeteilt werden können: SK-Kanäle (geringe Leitfähigkeit), BK-Kanäle (hohe Leitfähigkeit) und IK-Kanäle (mittlere Leitfähigkeit). Sie werden durch ein Ansteigen der intrazellulären Ca2+-Konzentration, wie sie während eines Aktionspotentials auftritt, aktiviert und zeigen keine Spannungsabhängigkeit der Aktivierung. SK-Kanäle sind in physiologische Prozesse wie Lernen, Erinnerungsvermögen, Regulation des Tagesrhytmus und Unterbrechung des normalen Schlafmusters involviert. Das SK2-Protein der Ratte (rSK2) wurde in Pichia pastoris-Zellen überexprimiert, um das Protein zu reinigen und genügend Material für strukturelle Studien zu erhalten. Dazu wurde die rSK2-cDNA in das Pichia Pastoris-Expressionssystem kloniert. Elektronenmikroskopische Lokalisationsstudien wie Immunogold-Markierung und Gefrierbruch-Analyse zeigten, daß der SK2-Kanal hauptsächlich an der Oberfläche des Endoplasmatischen Retikulums oder andersartigen internen Membranstrukturen lokalisiert ist. Dies steht im Gegensatz zu neuronalen Zellen, in denen das Protein eher in der Plasmamembran zu finden ist. Die Solubilisierung des Kanalproteins mit Detergentien war besonders schwierig zu erreichen. Von 15 getesteten Detergentien konnte das Kanalprotein nur mit Digitonin aus der Membran gelöst werden. Verschiedene chromatographische Verfahren wurden zur Reinigung des Kanals eingesetzt, aber das Protein wurde nur teilweise gereinigt und die Ausbeute war gering. Eine Gelfiltrationsanalyse zeigte, daß der gereinigte SK2-Kanal wie andere Kaliumkanäle als Homotetramer vorlag (MacKinnon 1991). Um einen verbesserten Einbau in die Plasmamembran zu erreichen, wurde versucht, ein weiteres SK2-Konstrukt zu exprimieren. Dieses verfügte über eine zusätzliche sechs Aminosäuren umfassende Sequenz (FCYENE), welche sich als bedeutsam für die Membranlokalisation anderer Kaliumkanäle herausgestellt hatte (Ma et al. 2001). Die Sequenz war an den Carboxyterminus angefügt. Der Effekt dieser Sequenz auf die SK2-Expression in Pichia pastoris wurde untersucht. Dies zeigte, daß die FCYENE-Sequenz keinen Effekt auf den gesamt-Expressionslevel bindungskompetenter Kanäle hatte. Digitonin, TritonX-100, n-Dodecyl-beta-D-maltosid (DDM) und Octyl-glycosid erlaubten eine Solubilisierung des SK2-FCYENE-Proteins. Dies zeigte, daß die FCYENE-Sequenz einen bemerkenswerten Effekt auf die Löslichkeit des SK2-Proteins hatte. Im Gegensatz zum Wildtyp zeigte das SK2-FCYENE-Protein auch eine veränderte Verteilung innerhalb der Hefezellen. Es lag nicht nur im Endoplasmatischen Retikulum, sondern auch konzentriert in Vesikeln vor. Trotzdem waren wie zuvor nur geringe Mengen an Protein in der Plasmamembran zu finden. Offenbar kann die FCYENE-Sequenz zwar den Austritt aus dem Endoplasmatischen Retikulum fördern, aber die Kanäle werden nicht in die Plasmamembran translokiert. Trotz der erhöhten Menge an löslichem Ausgangsmaterial wurde die Menge an gereinigtem Kanalprotein nicht nennenswert erhöht. Die Calcium-Sensitivität der SK-Kanäle wird durch eine Wechselwirkung mit Calmodulin hervorgerufen (Xia et al. 1998; Schumacher et al. 2001). Die Bindung zwischen Calmodulin und SK2-Protein ist nicht nur für das Öffnen, sondern auch für den Transport des Kanals essentiell (Lee et al. 2003). Deshalb wurde das SK2-Protein in tandem mit Calmodulin kloniert (SK2-q-CaM), wobei ein Verbindungsstück aus zehn Glutaminresten die beiden Proteine verband. Das Calmodulin veränderte dramatisch die Verteilung des Kanalproteins in der Zelle. Dies zeigte die Immunogold-Markierung des SK2-q-CaM-Proteins in den Pichia pastoris-Zellen. Einige der SK2-q-CaM-Chimären waren in der Plasmamembran lokalisiert. Ferner war die Effektivität der Solubilisierung mit Detergenz weitaus höher als für das wildtyp- und das SK2-FCYENE-Protein. Trotz der enormen Verbesserung der Löslichkeit war die Ausbeute an SK2-q-CaM-Protein geringer als für die beiden anderen Konstrukte, was vermutlich auf eine veränderte Verfügbarkeit der His-Sequenz durch die Wechselwirkung mit Calmodulin zurückzuführen war. Das SK2-Protein wurde zudem in der Säugerzelllinie BHK (Baby Hamster Kidney) unter Verwendung des Semliki Forest Virus-Systems exprimiert. Das Protein erreichte 24 h nach Virusinfektion einen hohen Expressionslevel. Eine Immunogold-Markierung bestätigte, daß das SK-Protein in die Plasmamembran eingebaut wurde, wenngleich ein Großteil des Proteins in den Membranen des Endoplasmatischen Retikulums verblieb. Apamin band mit hoher Affinität an das Kanalprotein, wobei die Daten der Sättigungskurven auf eine einzelne Bindungstelle hinwiesen. Diese Werte und Daten aus kompetitiven Verdrängungs-Experimenten waren mit jenen Werten, die mit nativen Hirnmembranen gemessen wurden, vergleichbar (Marqueze, Seagar et al. 1989; Wadsworth, Doorty et al. 1994; Wadsworth, Torelli et al. 1997). Das Kanalprotein ließ sich erfolgreich mit verschiedenen Detergentien, vor allem mit DDM, aus der Membran lösen. Mittels Ionenaustausch-Chromatographie konnten 0,1-0,2 mg/ml reines SK-Protein erhalten werden. Gelfiltrations-Chromatographie und Blau-Nativ Gelelektrophorese (BN-PAGE) zeigten, daß das reine Kanalprotein wie erwartet als Tetramer vorlag. Bis heute gibt es keine weiteren Berichte von gereinigtem SK2-Protein aus natürlicher oder rekombinanter Quelle. Trotz der relativ geringen Proteinausbeute ist die gelungene Reinigung des Proteins daher eine zentrale Erkenntnis für die Charakterisierung von SK-Kanälen.