Modulation der Erythropoetinsynthese in HepG2-Zellen durch das Immunsuppressivum Mycophenolat Mofetil in vitro

Modulation of erythropoietin synthesis in HepG2 cells by the immunosuppressant drug mycophenolate mofetil in vitro

  • Das Hormon Erythropoetin (EPO) ist ein hitzestabiles Glykoprotein, welches als wesentlicher Wachstumsfaktor an der Erythropoese beteiligt ist. EPO wird sauerstoffabhängig in Leber und Niere synthetisiert. Da EPO in Zellen nicht gespeichert wird, ist seine Sekretionsrate durch die Syntheserate bestimmt. Unter Hypoxie wird über einen hypoxieinduzierbaren Faktor (HIF-1) die Transkription des EPO-Gens angeregt. Mycophenolat Mofetil (MMF) wird erfolgreich bei transplantierten Patienten als Immunsuppressivum eingesetzt. MMF ist ein nichtkompetitiver, reversibler Hemmer der Inosinmonophosphatdehydrogenase (IMPDH), die essentiell für die de novo Purinsynthese in Lymphozyten ist. MMF soll selektiv antiproliferativ auf Lymphozyten wirken, ohne einen unspezifischen knochenmarkdepressiven Effekt zu haben. Trotzdem wurden bei bis zu 15% der nierentransplantierten und nahezu der Hälfte aller herztransplantierten Patienten unter immunsuppressiver Therapie mit MMF Anämien beschrieben. Die Genese dieser Anämien ist noch unklar und könnte durch eine reduzierte EPO-Produktion unter MMF bedingt sein. In dieser Untersuchung wird deshalb der Effekt von MMF auf die EPO-Freisetzung aus HepG2-Zellen in vitro analysiert. HepG2 und Hep3B Zellen sind ein etabliertes Zellkulturmodell zur Untersuchung der Regulierung hypoxieabhängiger EPO-Sekretion. MMF vermindert zeit- und konzentrationsabhängig die mittels ELISA gemessene EPO-Konzentration im Zellüberstand von HepG2-Zellen &#8211; im Mittel etwa auf die Hälfte des Ausgangswertes (p < 0, 001). Dieser Effekt ist signifikant ab einer Konzentration von 0,1 µM MMF und maximal bei 5 µM MMF. Eine signifikante Inhibition der EPO-Sekretion war erst nach 48stündiger Inkubation mit MMF nachweisbar. Unspezifische Effekte auf Proliferation und Proteinsynthese sowie zytotoxische Effekte wurden mittels verschiedener unabhängiger Methoden weitgehend ausgeschlossen. Der Effekt von MMF auf die EPO-Sekretion konnte durch Zugabe von Guanosin aufgehoben werden, was für eine kausale Rolle der IMPDH in diesem Zusammenhang spricht. Analog zu der sezernierten EPO-Menge verminderte sich auch die Menge der gebildeten EPO-mRNA unter MMF. Zudem ist die Aktivität von HIF-1 unter MMF gemindert. Im Gegensatz zu MMF zeigen andere Immunsuppressiva wie der Purinsynthesehemmer Azathioprin und die Calcineurininhibitoren Cyclosporin A und Tacrolimus keinen spezifischen Effekt auf die EPO-Freisetzung von HepG2-Zellen. Die Ergebnisse weisen darauf hin, daß die Minderung der EPO-Sekretion im Zellkulturmodell ein Erklärungsansatz für die beobachteten Anämien unter MMF sein könnte. Eine Therapie der Anämie mittels EPO-Substitution erscheint daher sinnvoll.
  • The hormone erythropoietin (EPO) is a heat-stable glycoprotein which is the main growth factor for erythropoiesis. EPO is synthesized in the adult kidney and in the liver in an oxygen-dependent manner. After hormone synthesis EPO is not being stored, but rather directly secreted as an active metabolite. During hypoxia, the transcription of the EPO-gene is stimulated via the so-called &#8221;hypoxia-inducible factor&#8220; (HIF-1). Mycophenolate mofetil (MMF) has been successfully used as an immunosuppressant after renal transplantation. MMF is a non-competitive, reversible inhibitor of inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH), the essential enzyme of the de novo purine synthesis in lymphocytes. MMF is an antiproliferative agent predominantly for lymphocytes without causing severe bone marrow suppression. Nevertheless, anemia has been observed in up to 15% of the renal transplant patients and approximately in half of the heart transplant recipients under therapy with MMF. The pathogenesis of this MMF-associated anemia is still under investigation and might be caused by a reduced production of EPO due to MMF. In this study, the effect of MMF on the release of EPO from HepG2 cells is analyzed in vitro. The cell lines HepG2 and Hep3B are established models in regard to the regulation of hypoxia-dependent EPO-secretion. MMF reduces the concentration of EPO in the cell culture supernatant of HepG2 cells in vitro in a time- and dose-dependent manner. EPO measured by ELISA is reduced to almost half of the initial dose (p < 0, 001). This effect is significant starting at a concentration of 0,1 µM MMF and reaches its maximum at 5 µM MMF. A significant inhibition of the EPO secretion was found only after an incubation period of 48 hours with MMF. Non-specific or cytotoxic effects were excluded by various independent methods. The effect of MMF on the secretion of EPO in HepG2 cells was antagonized by guanosine. This indicates the central role of IMPDH within this context. Parallel to the secreted amount of EPO, the amount of EPO-mRNA in HepG2 cells under MMF is diminished. In addition, the activity of HIF-1 is reduced under incubation with MMF. On the other hand, other immunosuppressants like the purine synthesis-inhibitor azathioprine and the calcineurin inhibitors cyclosporine A and tacrolimus did not exhibit a specific effect on the secretion of EPO from HepG2 cells. The results indicate that the reduction of the secretion of EPO in cell culture might cause the anemia observed under MMF therapy. A substitution with EPO seems to be indicated in those forms of anemia.

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Metadaten
Author:Rafael Marc Reuter
URN:urn:nbn:de:hebis:30-51191
Referee:Ingeborg A. HauserGND, Wolf Otto BechsteinORCiDGND
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2007/11/14
Year of first Publication:2005
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2007/11/06
Release Date:2007/11/14
Tag:HIF-1; HepG2
HIF; anemia; erythropoietin; hypoxia; mycophenolatemofetil
GND Keyword:Immunsuppression; Mycophenolatmofetil; Erythropoietin; Zellkultur; Azathioprin; Ciclosporin; Anämie; Transplantation; Hypoxie; Genregulation
HeBIS-PPN:191809012
Institutes:Medizin / Medizin
Dewey Decimal Classification:6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht