Open Access

Anna-Maria Kashiotis

• Die im Mittelhirn lokalisierten dopaminergen (DA) Neurone sind in einer Vielzahl von Hirnfunktionen involviert und werden aufgrund von anatomischen, molekularen sowie funktionellen Unterschieden in mehrere Subpopulationen aufgeteilt. DA Neurone, die in der Substantia nigra (SN) pars compacta lokalisiert sind, spielen durch ihre Projektion in das dorsale Striatum eine Rolle in der Steuerung der Willkürmotorik. Die Area tegmentalis ventralis (VTA) enthält DA Neurone, die in den präfrontalen Cortex, die basolateralen Amygdala sowie den Nucleus accumbens projizieren und in höheren kognitiven Funktionen, wie dem Arbeitsgedächtnis, der Motivation sowie belohnungsassoziierten Lernvorgängen involviert sind. In dieser Arbeit wurden die differentiellen Eigenschaften des transienten A-Typ Kaliumstroms sowie dessen Funktion für die intrinsische elektrische Aktivität und die Integration von synaptischen Eingängen in Subpopulationen von DA Neuronen untersucht. Dieser spannungsgesteuerte Strom ist an der Kontrolle der Schrittmacheraktivität beteiligt, beeinflusst die Form und Dauer von Aktionspotentialen und moduliert die Erregbarkeit des somatodendritischen Kompartiments. Der A-Typ Kaliumkanal besteht in DA Neuronen aus einem Tetramer von porenbildenden KV4.3 α-Untereinheiten. Die Koexpression von akzessorischen β-Untereinheiten moduliert maßgeblich die biophysikalischen Parameter des A-Stroms, wie z. B. die Kinetik der Inaktivierung sowie die Spannungsabhängigkeit der Aktivierung und Inaktivierung. Zu diesen β-Untereinheiten gehören die cytoplasmatischen Kaliumkanal-interagierenden Proteine (KChIPs) sowie die transmembranären Dipeptidylpeptidase-ähnlichen Proteine (DPPLs). Während in DA SN Neuronen vor allem KChIP3 exprimiert wird und einen schnell inaktivierenden A-Strom gewährleistet, sind DA VTA Neurone durch die zusätzliche Expression der KChIP4a Splice-Variante charakterisiert, welche durch Inhibition der schnellen Inaktivierung in einem langsam inaktivierenden A-Strom resultiert. Die Bedeutung der differentiellen KChIP4a-Expression für DA Mittelhirnneurone wurde mit Hilfe von KChIP4-Knock-Out (KO)-Mäusen untersucht. Alle Versuche wurden in vitro an akuten Hirnschnitten adulter Wildtyp (WT)- und KChIP4-KO-Tiere durchgeführt und die DA neurochemische Identität sowie die Lage der gemessenen Zellen im Anschluss immunhistochemisch bestätigt. Die biophysikalischen Eigenschaften des A-Stroms wurden mit der Patch-Clamp Technik in der nucleated outside-out Konfiguration untersucht, welche optimale Bedingungen für Voltage-Clamp Experimente gewährleistet. Der A-Strom in DA VTA Neuronen aus KChIP4-KO-Tieren wies dabei eine siebenfach schnellere Inaktivierungskinetik als in vergleichbaren Neuronen aus WT-Tieren auf, während die Inaktivierungskinetik in DA SN Neuronen aus KChIP4-KO-Tieren lediglich um den Faktor zwei schneller war. Außerdem wurde festgestellt, dass selektiv in DA VTA Neuronen das halbmaximale Aktivierungspotential ebenfalls von der KChIP4-Expression abhängig war. Somit konnte gezeigt werden, dass die Expression von KChIP4 für die charakteristischen A-Strom-Eigenschaften von DA VTA Neuronen verantwortlich ist. Die funktionelle Rolle des KChIP4-vermittelten langsamen A-Stroms wurde mit Hilfe von Current-Clamp Messungen in Ganzzellableitungen untersucht. Dabei wurde deutlich, dass die Expression von KChIP4 die Spontanaktivität von DA SN und VTA Neuronen nicht beeinflusst. Das für DA VTA Neuronen charakteristische verzögerte Wiedereintreten der Spontanaktivität nach einer Inhibition zeigte allerdings eine Abhängigkeit von der KChIP4-Expression, da der sog. rebound delay in DA VTA Neuronen aus KChIP4-KO-Tieren signifikant kürzer war, als in Zellen aus WT-Tieren. Dies konnte sowohl durch Strominjektionen, die in ihrer Kinetik GABAergen synaptischen Eingängen ähnelten, als auch nach direkter Aktivierung von GABA-Rezeptoren durch iontophoretische GABA-Applikation bestätigt werden. KChIP4 könnte somit einen internen Verzögerungsmechanismus nach einer transienten Inhibition von DA Neuronen gewährleisten, die z.B. bei Präsentation von aversiven Stimuli sowie beim Ausbleiben von erwarteten Belohnungen auftritt. Somit könnte die physiologische Relevanz des KChIP4-gesteuerten A-Stroms in der Integration von inhibitorischen synaptischen Eingängen im Kontext von belohnungsgesteuerten Lernprozessen liegen.
• Midbrain dopamine (DA) neurons are involved in a variety of brain functions and are divided into different subpopulations according to anatomical, molecular and functional differences. DA neurons located in the substantia nigra (SN) pars compacta play an important role in the control of voluntary movement through their projections to the dorsal striatum. The ventral tegmental (VTA) comprises subpopulations of DA neurons, which project to the prefrontal cortex, the basolateral amygdala and the nucleus accumbens and are involved in higher cognitive functions, including working memory, motivation and reward-driven learning. The present thesis focuses on the differential properties of the transient A-type potassium current, as well as its function in the intrinsic activity and integration of synaptic inputs in subpopulations of DA neurons. This voltage-gated channel is involved in the control of spontaneous activity, affects form and duration of action potentials and modulates the excitability of the somatodendritic compartment. The A-type K+-channel in DA neurons is composed of a tetramer of pore-forming KV4.3 α-subunits. The coexpression of auxiliary β-subunits modulates various biophysical properties of the A-current, such as the kinetics of inactivation and the voltage-dependency of activation and inactivation. β-subunits include the cytoplasmatic potassium channel interacting proteins (KChIPs) and the membrane-spanning dipeptidyl-peptidase-like proteins (DPPLs). DA SN Neurons predominantly express KChIP3, which guarantees a fast inactivating A-current, whereas DA VTA neurons additionally express the KChIP4a splice-variant, which results in a slow A-current inactivation, through an inhibition of the fast inactivation. The relevance of the differential KChIP4a-expression for DA midbrain neurons was studied with the use of KChIP4-knock-out (KO) mice. All experiments were performed in vitro in acute brain slices from adult wildtype (WT) and KChIP4-KO animals. The DA phenotype and the location of the measured cells were subsequently confirmed with the use of immunohistochemistry. The biophysical properties of the A-current were tested with the use of the patch clamp technique in the nucleated outside-out configuration, which ensures optimal conditions for voltage-clamp experiments. The A-current of DA VTA Neurons from KChIP4-KO animals displayed a sevenfold faster inactivation than of comparable neurons from WT-animals, whereas the kinetics of inactivation in DA SN Neurons from KChIP4-KO animals was accelerated only two-fold. Moreover, the potential of half-maximal activation depended on the expression of KChIP4 selectively in DA VTA neurons. This demonstrated that the expression of KChIP4 is necessary for the characteristic properties of the A-current in DA VTA neurons. The functional role of the KChIP4-mediated A-current was assessed with currentclamp recordings in the whole-cell configuration. The spontaneous electrical activity of DA SN as well as VTA neurons was independent of the expression of KChIP4. In DA VTA neurons the characteristic delay of the next action potential after an inhibition – called rebound delay – was found to depend on the expression of KChIP4, so that it was significantly shorter in DA VTA neurons from KO mice than in WT mice. This result could be replicated with current injections simulating those mediated by GABA-receptors, as well as with direct activation of GABA-receptors via iontophoretic application of the transmitter. KChIP4 could thus pose an internal delay mechanism for the inhibition of DA neurons, which occurs upon presentation of aversive stimuli or the absence of an expected reward, so that the physiological role of the KChIP4-modulated A-current could be found in the integration of inhibitory synaptic inputs in the context of reward-associated learning.