Untersuchung der Regulation und prognostischen Bedeutung von MLH1 und Spectrin alpha II

Neben ihrer Rolle in der DNA Mismatch Reparatur wird eine Beteiligung von MMR Proteinen an der Apoptoseinduktion, der Antikörperbildung sowie an der Mitose und Meiose beschrieben. Untersuchungen zu Partnerproteinen des M
Neben ihrer Rolle in der DNA Mismatch Reparatur wird eine Beteiligung von MMR Proteinen an der Apoptoseinduktion, der Antikörperbildung sowie an der Mitose und Meiose beschrieben. Untersuchungen zu Partnerproteinen des MMR Proteins MLH1 zeigten darüber hinaus eine Interaktion von MLH1 zu einigen Zytoskelett-assoziierten Proteinen. In der vorliegenden Arbeit sollte der Zusammenhang von MLH1 und nicht-erythroidem Spectrin alpha II (SPTAN1) auf Proteinebene untersucht und eine mögliche Beteiligung von SPTAN1 am DNA Mismatch Reparaturprozess mittels eines in vitro MMR-Assays analysiert werden. Die vergleichenden in vitro Analysen der MLH1 und SPTAN1 Expression erfolgten in fünf verschiedenen MLH1-profizienten und zwei MLH1-defizienten Zelllinien. Zudem wurde in vivo die Expression von MLH1 und SPTAN1 exemplarisch am Beispiel eines sporadischen sowie eines MLH1-defizienten Kolonkarzinomgewebes und des jeweils zugehörigen Normalgewebes durchgeführt. Im MMR-Assay wurden Kernextrakte aus HEK293T Zellen eingesetzte, in denen MLH1 und PMS2 bzw. MLH1, PMS2 sowie SPTAN1 überexprimiert wurde oder solche in denen die SPTAN1 Menge durch siRNA Behandlung zuvor reduziert worden war. Während die Untersuchungen hinsichtlich einer Beteiligung von SPTAN1 an der DNA Mismatch Reparatur keine eindeutigen Ergebnisse erbrachten, zeigten die Analysen der Expression von MLH1 und SPTAN1 interessanterweise sowohl in vitro als auch in vivo, dass die Proteinkonzentration von SPTAN1 bei MLH1-Profizienz deutlich höher war, als bei MLH1-Defizienz. Da SPTAN1 ein überaus wichtiges, filamentöses Gerüstprotein darstellt, an der Aktin-Vernetzung und der Stabilisierung der Plasmamembran beteiligt und mitverantwortlich für Organisation der intrazellulären Organellen ist, könnten die Expressions-unterschiede in MLH1-defizienten und MLH1-profizienten Zellen für die Progression und das Metastasierungsverhalten entsprechender Kolontumore eine wichtige Rolle spielen. Weiterführende Untersuchungen, die im Anschluss an diese Arbeit hinsichtlich des Einflusses der SPTAN1 Menge auf das Migrationsverhalten entsprechender Zellen durchgeführt wurden, zeigen, dass MLH1-defiziente Zellen SPTAN1 abhängig weniger stark migrieren, als die MLH1-profizienten Vergleichszellen. Möglicherweise ist die MLH1 abhängige Expression von SPTAN1 Grund dafür, dass Kolontumoren mit MLH1-Defizienz signifikant weniger zur Metastasierung neigen, als sporadische Kolonkarzinome, die MLH1 exprimieren. Ob dies wirklich zutrifft muss allerdings durch weitere nachfolgende Experimente noch weiter untersucht werden.
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Beside their function in DNA mismatch repair (MMR), MMR proteins have been shown to be involved in the induction of apoptosis, the development of antibodies as well as mitosis and meiosis. Moreover, the MMR protein MLH1 
Beside their function in DNA mismatch repair (MMR), MMR proteins have been shown to be involved in the induction of apoptosis, the development of antibodies as well as mitosis and meiosis. Moreover, the MMR protein MLH1 has been demonstrated to interact with a couple of cytoskelettal scaffolding proteins. In the current work the connection between MLH1 and the non-erythroid spectrin alpha II (SPTAN1) was analysed on protein level by Westernblotting. In addition, a possible participation of SPTAN1 in MMR was determined by MMR-Assay. The in vitro analysis of MLH1 and SPTAN1 expression was performed in five different MLH1-proficient and two MLH1-deficient cell lines. The in vivo expression of MLH1 and SPTAN1 was examined exemplarily in one sporadic MLH1-proficient and one MLH1-deficient colon cancer and the corresponding normal tissue, respectively. Nuclear extracts from HEK293T cells complemented with whole protein extracts of either MLH1 and PMS2 or MLH1, PMS2 and SPTAN1 overexpressing or siRNA SPTAN1 down regulated HEK293T cells were used for the MMR assay. While SPTAN1 participation in MMR did not show any clear result, Westernblot analysis of MLH1-proficient and MLH1-deficient cell lines or tissues showed that MLH1-proficient cells expressed significantly higher level of SPTAN1 compared to the MLH1-deficient ones in vitro as well as in vivo. Since SPTAN1 is an important filamentous membrane protein which takes part in actin interconnection, stabilisation of the plasma membrane and in the organisation of intracellular organelles, differences of SPTAN1 expression in MLH1-deficient and MLH1-proficient might play an important role in colon tumour progression. Following this examination, the influence of SPTAN1 was determined on cell migration and impaired cellular mobility could be detected in weakly SPTAN1 expressing MLH1-deficient compared to MLH1-proficient cells. Therefore, we suggest that MLH1-dependent expression of SPTAN1 might be one reason for less metastatic potential of MLH1-deficient colon carcinoma compared to MLH1-proficient ones. However, this needs to be improved by further analyses.
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Metadaten
Author:Franziska Nuber
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-386447
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Stefan Zeuzem, Gerhard Oremek
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2015/12/10
Year of first Publication:2014
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2015/06/01
Release Date:2015/12/10
Pagenumber:141
Note:
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS PPN:384590675
Institutes:Medizin
Dewey Decimal Classification:610 Medizin und Gesundheit
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License LogoArchivex. zur Lesesaalplatznutzung § 52b UrhG

$Rev: 11761 $