Differenzierung von Stammzellen aus Fettgewebe in epitheliale Tubuluszellen

  • Mesenchymale Stammzellen (MSC) rücken in der regenerativen Medizin und im Tissue Engineering immer mehr in den Vordergrund. Im Gegensatz zu embryonalen Stammzellen bergen sie keine ethischen Probleme und sind leicht zu isolieren. Die ursprünglich aus Knochenmark gewonnenen MSC können inzwischen aus vielen verschiedenen Quellen wie Nabelschnurblut [Kern et al. 2006], Dentalgewebe [Huang et al., 2009], Plazenta [Huang et al., 2009], Haut [Salvolini et al., 2009] und aus Fettgewebe isoliert werden [Zuk et al., 2001]. Der Immunphänotyp variiert zwischen den aus verschiedenen Quellen gewonnenen MSC nur gering. Die Gewinnung aus Fettgewebe hat den Vorteil, dass eine minimal invasive Prozedur und eine hohe Ausbeute zusammenkommen. Die Stammzellen aus Fettgewebe (ASC) können in der Therapie eingesetzt werden und zu der Regeneration von Geweben nach Verletzungen beitragen [Wong et al., 2008; Poulsom et al., 2001]. Der genaue Mechanismus mit dem die Stammzellen wirken ist allerdings noch nicht geklärt. Sowohl die Integration der MSCs in das Gewebe als auch ein rein parakriner Einfluss wurden nachgewiesen. Klar ist nur, dass ein positiver Effekt von einer Therapie mit MSC ausgeht [Mizuno et al., 2009]. In vivo sind Zellen verschiedenen Einflüssen ausgesetzt, die den Zustand einer Zelle bestimmen. Lösliche Faktoren wie Wachstumsfaktoren, Hormone oder Vitamine wirken dabei ebenso wie die extrazelluläre Matrix und Zell-Zell-Kontakte auf die Zelle ein, die mit Wachstum, Zellform, Differenzierung oder Ähnlichem antwortet. In meiner Arbeit wurden daher drei unterschiedliche Ansätze für die in vitro Differenzierung von ASC in epitheliale Tubuluszellen untersucht: (1) die Wirkung von löslichen Faktoren, die dem Medium zugesetzt wurden, (2) der Einfluss der extrazellulären Matrix aus zum einen Tubuluszellen und zum anderen Matrigel und (3) die Co-Kultur, bei der auch direkter Zell-Zell-Kontakt untersucht wurde. Damit, und mit einer Kombination der einzelnen Bereiche, sollte das natürliche Umfeld der Tubuluszellen simuliert werden und epitheliale Differenzierung initiieren. Die Zugabe von ATRA, ActA und BMP-7 führte zu einer Differenzierung in die epitheliale Richtung, während die extrazelluläre Matrix aus Tubuluszellen nicht dafür ausreichte. Matrigel hingegen, konnte besonders in der Verbindung mit konditioniertem Medium eine Differenzierung induzieren. Die indirekte Co-Kultur über Membraneinsätze, über die u. a. der parakrine Einfluss der Tubuluszellen untersucht werden sollte, führte zu morphologischen Veränderungen der ASC, die aber nicht mit den hier verwendeten epithelialen Markern nachgewiesen werden konnte. Der direkte Zell-Zell-Kontakt zeigte eine Reduktion des Oberflächen Markers CD90 verbunden mit einer Erhöhung der Expression von CK18. Die Differenzierung von ASC in epitheliale Zellen ist also auf drei verschiedenen Wegen möglich. Zwischen verschiedenen Isolationen von ASC traten hohe Schwankungen bezüglich der Expression von Oberflächenmarkern und Proliferation auf, was auch einen Einfluss auf die Differenzierung haben könnte. Ein Grund dafür könnte die Heterogenität von ASC sein. Zur Reduzierung dieser wurden daher ein Waschschritt eine Stunde nach Kulturbeginn und eine immunomagnetische Isolation mit CD49a, CD90, CD105 oder CD271 durchgeführt. Die immunomagnetische Aufreinigung führte nur zu einer leichten Verbesserung der Heterogenität, aber zu einer sehr geringen Zellausbeute. Für den Waschschritt konnte gezeigt werden, dass die Expression der Stammzellmarker Nestin, oct4 und sall1 signifikant erhöht und Desmin und smA Expression reduziert wurden, was auf eine Reduktion der Heterogenität hindeutete. Der zusätzliche Waschschritt kann also schnell und unkompliziert die Heterogenität der ASC reduzieren. Die Differenzierung von ASC in epitheliale Tubuluszellen durch den Einfluss von Zell-Zell-Kontakten zeigt vielversprechende Ansätze und sollte weiter verfolgt werden. Eine verlängerte Kulturdauer sollte dabei angestrebt werden, da auch die adipogene Differenzierung zumeist erst nach 14 bis 21 Tagen nachweisbar war. Dafür müsste die Markierung mit CellTracker länger nachweisbar sein. Eine Inhibierung der Proliferation könnte die Grundlage dazu liefern. Um den Stand der Differenzierung in die epitheliale Richtung nachzuweisen, könnten andere epitheliale Marker, Ionenkanäle, die erst spät in den Tubuluszellen angelegt werden, und funktionelle Mechanismen untersucht werden. Das Zusammenspiel der verschiedenen Einflüsse auf die Zelle könnte ebenfalls noch genauer untersucht werden. Für die Regenerative Medizin ist es aus Gründen der GMP sinnvoller, die Zellen nur mit dem Zusatz an löslichen Faktoren zu differenzieren. Der Ansatz mit ATRA, ActA und BMP-7 scheint sehr vielversprechend zu sein und könnte in dieser Hinsicht weiter ausgebaut werden.
  • In regenerative medicine and tissue engineering, mesenchymal stem cells (MSC) get more and more in the focus. Originally obtained from bone marrow, MSC are now derived from different tissues, showing only small differences in immunophenotype or differentiation potential. Fatty tissue is easily accessable with a minimal invasive procedure, leading to a high amount of MSC. These adipose derived stem cells (ASC) have the same marker panel, differentiation capability and adherence to plastik as bone marrow derived MSC. In earlier studies it was believed, that MSC can only differentiate in celltypes of mesodermal origin as adipocytes, osteoblasts and chondrocytes. Recently, those limitations were disproved as the differentiation into hepatocytes [Banas et.al., 2007; Lange et al., 2006], neural [Krampera et al., 2006], endothelial [Cao et al., 2005], and epithelial cells [Brzoska et al., 2005] was shown. Acute kidney injury is mostly regulated by self-repair, but in some cases patients do not recover. Regenerative medicine using ASC might be a solution for the treatment of kidney injuries. It could already be proven that the use of stem cells can positively influence regeneration [Chen et al., 2004; Tögel et al., 2005]. In vivo a cell is defined through many different influences like a multitude of soluble factors (growth factors, cytokines, hormones and vitamins), as well as the extracellular matrix and cell-cell-contact. My thesis investigates therefore three different ways, which might possibly lead to an epithelial differentiation of ASC: (1) the addition of growth factors and cytokines to the culture medium, (2) the influence of extracellular matrix both derived from tubular cells and Matrigel, and (3) indirect and direct cell-cell-contact. It could be shown that a combination of all-trans retinoic acid, activin A and BMP-7 significally enhanced the expression of the epithelial markers cytokeratin 18 and zona occludens 1, while the extracellular matrix derived from tubular cells did not change this markers on ASC. However, for the differentiation into epithelial cells, direct cell contact showed also a good prospect to induce differentiation of ASC. Meanwhile, culture on Matrigel might change the ASC into epithelial direction depending on the cells, which display a great heterogeneity coming from different donors and thus different isolations. Since ASC are a heterogeneous mixture of cells, which could influence the differentiation potential, an attempt was made to reduce the heterogeneity by an additional washing step and immunomagnetic isolation by CD49a, CD90, CD105 or CD271. A washing step after one hour proved to reduce the heterogeneity of ASC and was more effective than immunomagnetic isolation with a much higher cell yield.

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Metadaten
Author:Nadine Griesche
URN:urn:nbn:de:hebis:30-78116
Referee:Jürgen Bereiter-HahnORCiDGND
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/07/13
Year of first Publication:2010
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2010/06/30
Release Date:2010/07/13
HeBIS-PPN:224979930
Institutes:Biowissenschaften / Biowissenschaften
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht