Open Access

Dominique Rastädter

• In view of the diverse functionalities of RNA, the search for tools suitable for regulating and understanding RNA grows continuously. Dysfunction of RNA controlled processes can lead to diseases, calling for external regulation mechanisms – a difficult task in view of the complexity of biological systems. One of the recently developed methods that aim to systematically control RNA relates to photoregulation. Here, the RNA functions are triggered by photochromic molecules – for example, azobenzene or spiropyran – which are bound either covalently or non-covalently to the target RNA. This is a flexible approach, which can be improved by using suitably substituted chromophores. However, many issues regarding the details of photocontrol are still open. A detailed understanding of the mechanism of photocontrol is therefore of crucial importance. The present thesis explores theoretical approaches to the photocontrol of RNA, focussing upon azobenzene chromophores covalently bound to RNA. The aim of the thesis is to characterize, at a molecular level, the effect of trans-to-cis isomerization of the azobenzene chromophore on RNA, and thus understand the mechanism of RNA unfolding triggered by azobenzene isomerization. In particular, we attempt to answer the following questions: How does azobenzene isomerization happen in an RNA environment, i.e., how is the isomerization influenced by the local RNA environment? Conversely, how is RNA dynamics, on a longer time scale, affected by azobenzene attachment and photoisomerization? Further, can regulation be enhanced by substituted azobenzenes? And, does simulation yield a picture that is consistent with experiment? Due to the very different times scales of azobenzene isomerization (femtoseconds to picoseconds) and the much slower RNA response (nanoseconds to milliseconds), complementary techniques have been chosen: (i) hybrid quantum-classical approaches, i.e., on-the-fly Quantum Mechanics/Molecular Mechanics (QM/MM), to characterize the isomerization and RNA response on an ultrafast time scale, and (ii) molecular dynamics with enhanced sampling techniques, in particular, Replica Exchange MD (REMD), to explore longer time scales where the effect of RNA unfolding becomes manifest. Furthermore, substituent effects on azobenzene were separately investigated, in collaboration with two experimental groups. The first part of this thesis is focused on the conformational influence of azobenzene on a small RNA hairpin on longer time scales using REMD simulations. In accordance with experiment, it is found that both the trans and cis form of azobenzene destabilize the RNA system. Trans azobenzene stays stacked in the double strand, whereas the cis form flips out of the RNA. These stacking interactions are the main reason why a trans azobenzene-RNA-complex is more stable than a cis-azobenzene-RNA-complex. Furthermore, the loop region of the RNA hairpin is highly destabilized by the intercalation of azobenzene. In the second part, on-the-fly QM/MM simulations of the same azobenzene substituted hairpin are undertaken. These simulations use a surface hopping (SH) algorithm in conjunction with hybrid QM/MM electronic structure calculations to give a complete picture of the isomerization process on a picosecond time scale. It is shown that, due to the constraints of the RNA environment, the isomerization time of the azobenzene chromophore is significantly increased (from 300 femtoseconds in the gas phase to around 20 picoseconds in the RNA environment), and the isomerization yield is low. To the best of our knowledge, these are the first QM/MM simulations reported for azobenzene in a nucleic acid environment. In the third and final part of this thesis, the properties of substituted azobenzenes have been explored, in collaboration with two experimental groups at the department. In particular, para- and meta-hydroxy substituted azobenzenes were suggested as improved photoswitches for the photoregulation of RNA, but spectroscopic investigations showed that isomerization was inefficient in some of the investigated species. Therefore, we investigated the photoisomerisation pathway of the keto/enol-form of para- and meta-hydroxy-azobenzenes by Time-Dependent Density Functional Theory (TDDFT) calculations. These calculations show that the competing keto/enol-tautomerism can result in an unstable cis form, making these substituted chromophores unsuitable as photoswitches. Overall, the present thesis has contributed to obtaining a molecular-level understanding of photocontrol in azobenzene substituted RNAs, showing that theory and simulations can provide useful guidance for new experiments.
• Ribonukleinsäuren (RNA) spielen eine zentrale Rolle in vielen biologischen Abläufen wie der Proteinbiosynthese und der Genregulation. Daher ist es von größtem Interesse, diese RNA-basierten Prozesse zu verstehen und zu steuern. Zudem führen RNA-Fehlfunktionen oft zu schwer heilbaren Krankheiten und gerade deshalb kommt der externen Regulierung eine große Bedeutung zu. Bereits jetzt ist es möglich, mit Hilfe kleiner Liganden nicht-kodierende RNA zu steuern. Eine andere Möglichkeit erschließt sich durch die Verwendung von reversiblen molekularen Lichtschaltern. Molekulare Schalter – wie etwa Azobenzole oder Spiropyrane – ändern nach Lichtanregung ihre Konformation oder ihr Dipolmoment, so dass sich ihr Einfluss auf ihre Umgebung gezielt steuern läßt. Diese Eigenschaft kann man sich zunutze machen, indem Schalter-RNA Komplexe gebildet werden; dabei interagiert der Lichtschalter mit der RNA und steuert diese aktiv. Trotz der bereits erfolgreichen Anwendung von molekularen Lichtschaltern in biologischen Systemen sind der Aktivierungsmechanismus und der Einfluss des Lichtschalters noch nicht vollständig aufgeklärt. Ein detailliertes Verständnis der lichtinduzierten Isomerisierung ist deshalb entscheidend. Vor diesem Hintergrund befasst sich die vorliegende Arbeit mit der computergestützten Aufklärung der Lichtregulierung in einem Azobenzol-RNA Modellsystem. Diese Arbeit wurde im Rahmen des Frankfurter Sonderforschungsbereichs SFB 902 ("Molecular Principles of RNA-Based Regulation") angefertigt. Dabei sollen insbesondere folgende Fragen beantwortet werden: 1. Wie beeinflusst die Konformationsänderung des Azobenzols die Stabilität einer typischen RNA-Schleife oder -Haarnadel? Sind die theoretischen Resultate direkt mit experimentell bestimmten Schmelztemperaturen vergleichbar? 2. Wie verläuft der lichtinduzierte Isomerisierungsprozess von Azobenzol innerhalb der RNA und wie modifiziert die RNA-Umgebung diesen? 3. Kann die Lichtregulierung durch substituierte Azobenzole verbessert werden? Wieso sind nicht alle Hydroxyazobenzole geeignete Lichtschalter? Die hochdiversifizierten Funktionen der RNA werden durch ihre Sekundärstruktur bestimmt, die überwiegend durch Basenpaarung und Basenstapelung definiert ist. Aus den Sekundärstrukturen bilden sich wiederum Tertiärstrukturen, die eine funktionelle RNA konstituieren. Es kann angenommen werden, dass die Steuerung der Sekundärstrukturen auch die Steuerung der eigentlichen Funktion ermöglicht. Ein wichtiger Indikator für die Stabilität – und damit die Funktionalität – einer RNA Struktur ist der Schmelzpunkt der betreffenden RNA. Fördert nun ein Photoschalter die Stabilität der RNA, so erhöht sich der Schmelzpunkt im Verhältnis zur nativen RNA. Dagegen ist bei einer Erniedrigung des Schmelzpunktes die Funktionalität der RNA beeinträchtigt oder sogar desaktiviert. So wird in DNA-Duplexstrukturen durch den Einbau von trans-Azobenzol die Stabilität erhöht, während die aus der Photoschaltung resultierende cis-Form destabilisierend wirkt, so dass sich der Schmelzpunkt verringert. In RNA-Strukturen ist dieser Effekt typischerweise schwächer ausgeprägt. Daher ist es von großem Interesse, auf molekularer Ebene zu verstehen, wie etwa ein Photoschalter die RNA- oder DNA-Struktur stabilisiert bzw. destabilisiert und wie man diese Eigenschaften durch Substituenten gezielt steuern kann. Zur Untersuchung der Stabilität von RNA-Schalter-Komplexen betrachten wir ein relativ kleines Modellsystem, das aus einem kurzen Helixstamm mit fünf Basenpaaren und einer Viererschleife (Tetraloop) besteht, welche die komplementären Stränge der Helix miteinander verbindet. Diese beiden Grundformen kommen in den meisten natürlichen RNA-Strukturen vor und bilden somit ein hervorragendes repräsentatives Testsystem, um die Lichtregulierung der RNA zu untersuchen. Der Lichtschalter ist mittig in der Helix interkaliert und nur an einem Strang mit Hilfe eines Linkers kovalent gebunden. Die lichtinduzierte trans-cis-Isomerisierung von Azobenzol ist ein ultraschneller Prozess – im Bereich von Femtosekunden bis Pikosekunden – während die RNA-Faltungsprozesse eine breite Zeitskala von Nanosekunden bis Minuten abdecken. Es handelt sich damit um ein Multiskalenproblem, das eine Kombination verschiedener Methoden erfordert. Die ultraschnellen Prozesse, die in elektronisch angeregten Zuständen ablaufen, betrachten wir mit Hilfe von sogenannten QM/MM (Quantum Mechanics/Molecular Mechanics)-Hybridmethoden, die mit nichtklassischer "Surface Hopping"-Dynamik kombiniert werden. Diese Methodik ist typischerweise auf ca. 10-50 Pikosekunden begrenzt. Die langsameren Prozesse behandeln wir mit klassisch-mechanischen Molekulardynamik (MD)-Simulationen in Verbindung mit speziellen Sampling Techniken, insbesondere der sogenannten Replica-Exchange MD (REMD). Dabei ist zu bemerken, dass MD-Simulationen als solche nicht über den Mikrosekundenbereich hinausgehen. Insgesamt befasst sich diese Arbeit mit drei Bereichen, die im Folgenden skizziert werden: (i) Einfluss der trans- und cis-Konformationen eines kovalent gebundenen Azobenzol-Schalters auf die umgebende RNA, (ii) reziproker Einfluss der RNA-Umgebung auf den Azobenzol-Schalter, insbesondere auf ultrakurzen Zeitskalen, und (iii) nähere Untersuchung von Hydroxyazobenzol-Schaltern...