Open Access

Milan Gerovac

• Translation is a universal process in all kingdoms of life and organized in a cycle that requires ribosomal subunits (40S and 60S), messenger RNA (mRNA), aminoacylated transfer RNAs (tRNAs), and a myriad of regulatory factors. As soon as translation reaches a stop codon or stalls, a termination or surveillance process is launched via release factors eRF1 or Pelota (Dom34), respectively. The ATP-binding cassette (ABC) protein ABCE1 interacts with release factors at the ribosomal A-site and coordinates the recycling process in Eukarya and Archaea. Two asymmetric nucleotide-binding sites (NBSs) control and execute the ribosome splitting upon dimerization and closure of the two nucleotide-binding domains (NBDs). Ribosome nascent chain complexes (RNCs), ABCE1, and Dom34 from S. cerevisiae were produced for the reconstitution of splitting assays in order to probe for ABCE1’s actions in the splitting process with its native substrate. Translating ribosomes were stalled in vivo in a no-go situation on truncated mRNAs by a 3´-ribozyme motif that generates truncated mRNAs. The initiated decay mechanisms were circumvented by genomic deletion of the release factor Dom34 (Pelota) of the no-go decay machinery. The mRNA coded for an N terminal affinity purification tag (His-tag) and the green fluorescent protein (GFP) as a reporter of the translated nascent chain in the ribosomal complexes. RNCs were successfully in vivo stalled, enriched, and purified. In native gels, the reconstituted splitting experiments were analyzed by separation of RNCs, ribosomal subunits, and nascent chain-tRNA complexes based on the fluorescence readout of the GFP reporter. In addition, the anti-association factor eIF6 was added in the splitting reaction because it blocks the immediate re-association of ribosomal subunits after splitting. The anti-association activity of eIF6 was probed by an anti-/re-association assay, in which ribosomes are anti-associated by high salt and low magnesium conditions and in a second step re-associated. The re-association can be blocked by binding of eIF6 and other anti-associating factors to the ribosomal intersubunit sites. This approach allowed for the discovery of an anti-association activity of ABCE1 that was dependent on the non-hydrolysable ATP analog AMP-PNP. In addition, the formed complex between 40S and ABCE1 represented formally a post-splitting intermediate. In collaboration with the Beckmann lab, the structure of the post-splitting complex was reconstructed at 3.9 Å. The ABC system of ABCE1 is fully closed and its N-terminal iron-sulfur (FeS) cluster domain is rotated by 150-degree to a cleft at helix 44 and uS12. The FeS cluster domain is stabilized by interactions of Pro30 to uS12, Arg7 to helix 5, and the cantilever arm that links it to NBD1. Tyr301 of NBD1 stabilizes the FeS cluster domain in the rotated position by interaction to the backbone of the cantilever arm. Upon transition to the post-splitting state, the FeS cluster domain must clash with the release factor and push it in between the ribosomal subunits like a wedge and split the ribosome. In addition, in the post-splitting state, the FeS cluster domain would putatively clash with uL14 of the large ribosomal subunit, and this is the structural explanation for the anti-association effect of ABCE1. In Archaea, a similar conformation of the post-splitting complex was reconstructed in collaboration with the Beck and Beckmann labs and Kristin Kiosze-Becker and Elina Nürenberg-Goloub. Based on the high-resolution structure of the post-splitting complex, the post-splitting state of ABCE1 was identified in the 43S initiation complex 40S–ABCE1–tRNA–eIF2–eIF3. Subsequently, we proposed the post-splitting complex as a platform for initiation. In the quest to elucidate conformational dynamics of ABCE1, a reconstituted system was established to study conformational dynamics in real-time. Single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) was used for the relative distance detection between a donor and acceptor fluorophore. A cysteine-less ABCE1 variant was engineered with additional cysteines for fluorescent labeling by thiol-maleimide-coupling. In collaboration with Philipp Höllthaler, the double-cysteine variants were labeled for smFRET studies and alternating-laser excitation (ALEX) smFRET measurements were performed with ABCE1 and the small ribosomal subunit. ABCE1’s nucleotide-dependent NBD dimerization and FeS cluster domain rotation was determined in real-time. Finally, a higher opening and closing frequency of the NBDs was discovered than the determined ATPase rate. This observation could be explained by the hypothesis of elastic dimerization that is not immediately connected to ATP hydrolysis.
• Genetische Information wird von Desoxyribonukleinsäuren (DNS) in Boten-Ribo-nukleinsäuren (mRNS) kopiert (Transkription), welche wiederum am Ribosom in Proteine übersetzt wird (Translation). Das Ribosom setzt sich aus einer großen und kleinen Untereinheit zusammen, bestehend aus ribosomaler RNS (rRNS) und Proteinen. Im Zwischenraum der beiden Untereinheiten wird die mRNS gebunden und mittels aminoacylierter Transfer-RNS (tRNS) übersetzt. Die Aminosäuren im Protein werden durch Tripletts von Nukleobasen in der mRNS (Codons) und Anti-Codons auf der tRNS dekodiert. Im Peptidyl-Transfer-Zentrum der großen Untereinheit wird dabei das naszierende Peptid um jeweils eine weitere Aminosäure kovalent erweitert (Elongation) und bleibt während der gesamten Übersetzung an der tRNS gebunden. Am Ende der Translation wird das Protein von der tRNS abgelöst. Dazu wird das Stop-Codon durch proteinogene Entlassungsfaktoren (release factor, eRF1 und -3) erkannt und die Peptid-tRNS-Bindung hydrolysiert (Termination). Im Anschluss bindet das ATP-binding cassette (ABC) Protein E1 (ABCE1) an den Entlassungsfaktor im terminierten Ribosom (Prä-Spaltungskomplex) und katalysiert die Spaltung der ribosomalen Untereinheiten, die für eine weitere Translationsrunde zur Verfügung stehen. ABCE1 ist aus zwei Nukleotid-Bindedomänen (NBD1 und -2) aufgebaut, die komplementär zwei Nukleotid-Bindestellen (NBS I und II) formen. ABCE1 enthält eine N terminale Eisen Schwefel (FeS)-Cluster-Domäne. Durch Dimerisierung der beiden NBDs werden zwei Nukleosidtriphosphate eingeschlossen. Die dabei entstehende mechanische Energie aus der Dimerisierung wird an assoziierte Domänen übertragen, die mit dem Ribosom wechselwirken. Wenn die mRNS vor dem Stop-Codon geschnitten wird oder eine stabile Sekundärstruktur aufweist, führt dies zu einem mechanischen Anhalten der mRNS-Translation und es werden Kontrollprozesse des no-go decay eingeleitet zum Abbau von fehlerhafter mRNS, naszierendem Protein oder sogar assoziierter Faktoren. Der nicht-kanonische Entlassungsfaktor Pelota erkennt die angehaltenen ribosomalen Komplexe. ABCE1 kann analog zum Entlassungsfaktor auch an Pelota binden und spaltet das Ribosom. Die Peptid-tRNS wird bei den Kontrollprozessen nicht hydrolysiert, bleibt nach dem Spalten des Ribosoms in der großen Untereinheit verankert, und dient als Erkennungsmarker für die Markierung des naszierenden Peptids mit Ubiquitin für den proteasomalen Abbau. Für die Rekonstitution von in vitro Spaltungsexperimenten wurden in der Bäckerhefe spaltungskompetente Ribosomen als Substrat für ABCE1 in vivo programmiert angehalten und gereinigt. Durch Expression einer Reporter-mRNS mit selbst-prozessierenden 3’ Ribozym wurde die mRNS in vivo geschnitten und translatierende Ribosomen an dieser angehalten. Das Recycling der angehaltenen Ribosomen konnte durch das genetische Entfernen des Entlassungsfaktors Pelota (Dom34) verhindert und der angehaltene Zustand angereichert werden. N-terminal kodierte die mRNS für eine Polyhistidin-Markierung zur Affinitätsreinigung der angehaltenen ribosomalen Komplexe. Als Reporter für das kodierte Protein auf der mRNS wurde das grün fluoreszierende Protein (GFP) genutzt, welches zugleich als fluoreszierender Marker im naszierenden Protein diente. Das Spaltungsexperiment selbst war im Green Labor etabliert worden und gründet auf der Analyse von ribosomalen Untereinheiten durch native Gelelektrophorese. Hierbei beruhte die Detektion auf radioaktiv markiertem Peptid an der tRNS. Dieser Ansatz wurde genutzt für die Analyse der in vivo angehaltenen Ribosomen mittels Fluoreszenzdetektion via GFP-Reporter am naszierenden Protein und an der kleinen ribosomalen Untereinheit im nativen Polyacrylamid-Gel. Das in vitro rekonstituierte Spalten der angehaltenen Ribosomen erfordert neben dem Spaltungsfaktor ABCE1, den nicht-kanonischen Entlassungsfaktor Dom34 (in der Bäckerhefe) und den Antiassoziationsfaktor eIF6, der die Reassoziation der ribosomalen Untereinheiten nach dem Spalten verhindert. Das Spalten der in vivo angehaltenen Ribosomen wurde durch Zugabe von ABCE1/Dom34/eIF6 und Adenosintriphosphat (ATP) etabliert. Das naszierende Protein GFP verblieb dabei an der tRNS gebunden und in der großen ribosomalen Untereinheit verankert. Die Funktion von eIF6 wurde in einem Anti-/Reassoziationsansatz überprüft, in welchem die ribosomalen Untereinheiten dissoziieren und wieder assoziieren abhängig von der Kalium- und Magnesium-Konzentration. Bindet jedoch der Antiassoziationsfaktor eIF6 an die große Untereinheit, wird das Reassoziieren verhindert und die resultierenden ribosomalen Untereinheiten können mittels Sukrose-Dichtegradientenzentrifugation getrennt werden. Der Anti /Reassoziationsansatz wurde benutzt zur Überprüfung der Interaktion von ABCE1 mit der kleinen ribosomalen Untereinheit. Die ATP abhängige Interaktion wurde durch Verwenden des nicht-hydrolysierbaren ATP-Analogons AMP-PNP stabilisiert. Mithilfe diesen Ansatzes konnte der Komplex zwischen ABCE1 und der kleinen ribosomalen Untereinheit in vitro rekonstituiert werden, der formal den Post-Spaltungskomplex darstellt. ...