Mechanistic insights into ATP hydrolysis by the ABC transporter TAP

The transporter associated with antigen processing (TAP) plays a pivotal role in the adaptive immune response against virus-infected or malignantly transformed cells. As member of the ABC transporter family, TAP hydrolyz
The transporter associated with antigen processing (TAP) plays a pivotal role in the adaptive immune response against virus-infected or malignantly transformed cells. As member of the ABC transporter family, TAP hydrolyzes ATP to energize the transport of antigenic peptides from the cytosol into the lumen of the endoplasmic reticulum. TAP forms a heterodimeric complex composed of TAP1 and TAP2 (ABCB2/3). Both subunits contain a hydrophobic transmembrane domain and a hydrophilic nucleotide-binding domain. The aim of this work was to study the ATP hydrolysis event of the TAP complex and gain further insights into the mechanism of peptide transport process. To analyze ATP hydrolysis of each subunit I developed a method of trapping 8- azido-nucleotides to TAP in the presence of phosphate transition state analogs followed by photocross-linking, immunoprecipitation, and high-resolution SDS-PAGE. Strikingly, trapping of both TAP subunits by beryllium fluoride is peptide-specific. The peptide concentration required for half-maximal trapping is identical for TAP1 and TAP2 and directly correlates with the peptide-binding affinity. Only background levels of trapping were observed for low affinity peptides or in the presence of the herpes simplex viral protein ICP47, which specifically blocks peptide binding to TAP. Importantly, the peptideinduced trapped state is reached after ATP hydrolysis and not in a backward reaction of ADP binding and trapping. In the trapped state, TAP can neither bind nor exchange nucleotides, whereas peptide binding is not affected. In summary, these data support the model that peptide binding induces a conformation that triggers ATP hydrolysis in both subunits of the TAP complex within the catalytic cycle. The role of the ABC signature motif (C-loop) on the functional non-equivalence of the NBDs was investigated. The C-loops of TAP transporter contain a canonical C-loop (LSGGQ) for TAP1 and a degenerated ABC signature motif (LAAGQ) for TAP2. Mutation of the leucine or glycine (LSGGQ) in TAP1 fully abolished peptide transport. TAP complexes with equivalent mutations in TAP2 showed however still residual peptide transport activity. To elucidate the origin of the asymmetry of the NBDs of TAP, we further examined TAP complexes with exchanged C-loops. Strikingly, the chimera with two canonical C-loops showed the highest transport rate whereas the chimera with two degenerated C-loops had the lowest transport rate, demonstrating that the ABC signature motifs control the peptide transport efficiency. All single-site mutants and chimeras showed similar activities in peptide or ATP binding, implying that these mutations affect the ATPase activity of TAP. In addition, these results prove that the serine of the C-loop is not essential for TAP function, but rather coordinates, together with other residues of the C-loop, the ATP hydrolysis in both nucleotide-binding sites. To study the coupling between the ATP binding/hydrolysis and the peptide binding, the putative catalytic bases of the TAP complex were mutated to generate the so-called EQ mutants. The mutations did not influence the peptide-binding ability. Dimerization of the NBDs of EQ mutants upon ATP binding does not alter the peptide binding property. At 27°C, both ATP and ADP could induce the loss of peptide-binding ability (Bmax) only in the variants bearing a mutated TAP2. Further studies are required to deduce at which stage in the catalytic cycle the peptide-binding site is affected. In addition, mutation of the putative catalytic base of both subunits showed a magnesium-dependent peptide transport activity, demonstrating these mutants did not abolish the ATP hydrolysis. Thus, the function of this acidic residue as the catalytic base is not likely to be universe for all ABC transporters.
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Der menschliche Organismus ist in seiner Umgebung einer Vielzahl von Pathogenen ausgesetzt. Aufgrund dieses Selektionsdrucks hat sich im Laufe der Evolution bei den Vertebraten das adaptive Immunsystem entwickelt. Dieses
Der menschliche Organismus ist in seiner Umgebung einer Vielzahl von Pathogenen ausgesetzt. Aufgrund dieses Selektionsdrucks hat sich im Laufe der Evolution bei den Vertebraten das adaptive Immunsystem entwickelt. Dieses lässt sich in die humorale und die zelluläre Immunität unterteilen. Die humorale Immunantwort beschränkt sich auf die Produktion von Antikörpern durch B-Lymphozyten. Auftretende antigene Strukturen werden durch diese Immunglobuline markiert und nachfolgend beseitigt. Die zelluläre Immunantwort hingegen wird über T-Lymphozyten vermittelt. Innerhalb der Zelle werden Proteine durch das Proteasom degradiert. Die generierten Peptide werden im Komplex mit MHC I (major histocompatibility complex class I) Molekülen den CD8+-T-Lymphozyten präsentiert. Die Erkennung eines antigenen Peptids (z.B. viraler oder Tumor-assoziierter Herkunft) führt zur Zerstörung einer infizierten oder entarteten Zelle. Der Prozess der Generierung und MHC I-vermittelten Präsentation von Peptiden wird als Antigenprozessierung bezeichnet. TAP (transporter associated with antigen processing) erfüllt im Rahmen dieses Prozesses eine wichtige Aufgabe. Die durch das Proteasom produzierten Peptide werden von TAP aus dem Zytoplasma in das Lumen des Endoplasmatischen Retikulums (ER) transportiert. Nachfolgend werden diese Peptide auf MHC I Moleküle geladen und über den Golgi-Apparat auf der Zelloberfläche präsentiert. TAP gehört zur Familie der ABC (ATP binding cassette)-Transporter, welche ATPabhängig ein breites Spektrum an Substanzen über eine Membran transportieren. TAP formt einen Heterodimer bestehend aus TAP1 und TAP2. Jede Untereinheit wird aus einer N-terminale Transmembrandomäne (TMD) gefolgt von einer Nukleotidbindungsdomäne (NBD) gebildet. TAP1 und TAP2 werden auch als sogenannte half-size transporter bezeichnet. Die TMDs beider Untereinheiten bilden zusammen die Peptidbindungsstelle und formen die Translokationspore. TAP transportiert vornehmlich Peptide mit einer Länge von 8-16 Aminosäuren. Die Bindungsselektivität der Peptide wird durch die ersten drei N-terminalen und die letzte C-terminale Aminosäure bestimmt. Die zytoplasmatischen NBDs sind die Motordomänen von ABC-Transportern, die ATP hydrolysieren und die für den Transport benötigte Energie bereitstellen. Beide NBDs enthalten die für die Bindung und Hydrolyse von ATP essentiellen Walker A-, Walker Bund C-Loop-Motive. Diese Motive sind unter allen ABC-Transportern hoch konserviert. Die in der Walker B-Sequenz befindlichen Aminosäuren Asp688 (TAP1) und Glu632 (TAP2) werden als katalytische Basen bezeichnet, da sie wahrscheinlich ein Wassermolekül polarisieren, welches infolge dessen das -Phosphat des ATPs nukleophil angreift. Im Verlauf dieser Arbeit erschienen einige biochemische und biophysikalische Publikationen, die zeigten, dass die NBDs von ABC-Transportern in Anwesenheit von ATP Dimere bilden. Dabei werden an der Grenzfläche der zwei NBDs zwei Moleküle ATP komplexiert. An der Bindung eines ATP Moleküls sind die Walker A/B Motive und der C-Loop der benachbarten NBD beteiligt. Allerdings geht aus diesen Arbeiten nicht hervor, ob beide Motordomänen während des Substrattransportes katalytisch aktiv sind. Daher steht im Fokus der Forschung die Frage nach dem molekularen Mechanismus der Interaktionen beider NBDs innerhalb eines Transportzyklus. Frühere Studien an TAP hatten gezeigt, dass der Peptidtransport strikt mit der Peptidbindung und der Hydrolyse von ATP gekoppelt ist. Für den Peptidtransport ist die Anwesenheit beider NBDs essentiell. Allerdings wurde die ATPase-Aktivität der einzelnen NBDs bisher nicht nachgewiesen. Deswegen wurde im ersten Teil dieser Doktorarbeit der Frage nachgegangen, ob beide NBDs von TAP während des Transportprozesses katalytisch aktiv sind. Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Arbeit zuerst eine Methode etabliert, um die katalytische Aktivität der einzelnen Untereinheiten zu analysieren. Dabei werden 8-azido- Nukleotide mittels ATPase Inhibitoren fest an TAP gebunden. Diese Gruppe von ATPase- Inhibitoren stellen Phosphatanaloga (z.B. BeFx, ScFx oder Vi) dar, welche die Position des abgespaltenen - Phosphats des ATP einnehmen, wodurch sich ein stabiler Komplex aus Mg.8-Azido-ADP und einem Phosphatanalogon bildet. Die Komplexierung der Nukleotide mittels dieser Inhibitoren erfolgt nur nach ATP-Hydrolyse, womit eine Möglichkeit besteht, die katalytische Aktivität der einzelnen Untereinheiten zu verfolgen. Nach der Bindung des 8-Azido-Nukleotids wird durch die Bestrahlung der Probe mit UV-Licht eine kovalente Verknüpfung mit der NBD erzielt. Die TAP-Untereinheiten werden daraufhin immunpräzipitiert, durch hochauflösende PAGE separiert und über Autoradiographie visualisiert. Mit dem Inhibitor BeFx konnte 8-Azido-ADP effizient in den NBDs sowohl von TAP1 als auch TAP2 fest gebunden werden. Die Komplexierung von ADP durch BeFx wird durch die Anwesenheit von Peptid stimuliert. Somit scheint sowohl TAP1 als auch TAP2 peptid abhängig ATP zu hydrolysieren. Dabei korreliert die halbmaximale Stimulation der ATPase-Aktivität beider Untereinheit mit der Peptidaffinität. In Abwesenheit von Peptiden oder in Gegenwart des viralen TAP-Inhibitors ICP47 (Inhibition der Peptidbindung) wurde bei beiden NBDs nur eine geringe Hintergrund-Aktivität detektiert. In dem Mg.ADP.BeFx komplexierten Zustand kann TAP weder Nukleotide binden noch austauschen. Allerdings ist die Peptidbindung in diesem fixierten Zustand nicht beeinflusst. Basierend auf diesen Daten kann festgestellt werden, dass beide Untereinheiten des Peptidtransporters ATP in einer peptidabhängigen Weise hydrolysieren. Studien an Walker A Mutanten zeigen, dass beide Untereinheiten von TAP während des Transportprozesses asymmetrisch agieren. Ein Grund für diese funktionelle Asymmetrie könnte in den unterschiedlichen Sequenzen der C-Loops von TAP1 und TAP2 liegen. Während TAP1 (LSGGQ) die kanonische C-Loop-Sequenz besitzt, weist TAP2 (LAAGQ) einen sogenannten degenerierten C-Loop auf. Um den Einfluss der unterschiedlichen C-Loops auf die funktionelle Asymmetrie von TAP aufzuklären, wurden im Rahmen dieser Arbeit Mutationsstudien an den C-Loops durchgeführt. Zum einen wurden Aminosäurenreste ausgetauscht, welche sowohl in TAP1 (LSGGQ, mutierte Aminosäurenseitenketten sind unterstrichen) als auch TAP2 (LAAGQ) vorhanden sind. Die generierten C-Loop-Mutanten (1LA/2wt, 1GV/2wt, 1GD/2wt, 1wt/2LA, 1wt/2GV und 1wt/2GD) werden in gleichem Maße in Sf9-Insektenzellen exprimiert wie das Wildtyp- Protein (wt-TAP). Weiterhin konnten keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Peptidaffinität und der ATP-Bindung festgestellt werden. Allerdings weisen die Mutanten im Vergleich zum wt-TAP eine veränderte Transportaktivität auf. TAP-Komplexe, bei denen das Leucin bzw. Glycin in TAP1 (LSGGQ) mutiert wurde, zeigen keinen Peptidtransport. Dagegen besitzen TAP-Komplexe mit den entsprechenden Mutationen in TAP2 (LAAGQ) eine erniedrigte Transportaktivität. Dadurch wird jedoch verdeutlich, dass TAP1 und TAP2 funktional nicht identisch sind. Durch den Austausch der C-Loops zwischen TAP1 und TAP2 konnte gezeigt werden, dass die C-Loops zumindest teilweise für die funktionelle Asymmetrie der beiden Untereinheiten verantwortlich sind. Dabei transportieren TAP-Chimären mit zwei kanonischen C-Loops (LSGGQ) Peptide mit einer höheren Effizienz als TAP-Komplexe mit einem kanonischen C-Loop (LSGGQ) und einem degenerierten C-Loop (LAAGQ). Im Vergleich dazu transportieren TAP-Chimären mit zwei degenerierten C-Loops Peptide mit geringster Effizienz. Die Peptidbindungs- und Nukleotidbindungseffizienz der TAPChimären wurden nicht beeinflusst, so dass diese Mutationen wahrscheinlich ausschließlich die ATPase Tätigkeit verändern. Desweiteren belegen diese Mutationsstudien, dass das konservierte Serin des C-Loops (LSGGQ) für die katalytische Aktivität nicht essentiell ist. Dieses Serin kommt in allen menschlichen ABC-Transportern außer TAP2 vor und bildet eine Wasserstoffbrücke zum - Phosphat von ATP aus. Folglich beeinflussen Mutationen des hoch konservierten Serins des C-Loops die ATP-Hydrolysegeschwindigkeit und Mutationen des Leucins und Glycins (LSGGQ) die Dimerisierung der NBDs während des Transportzyklus. Offensichtlich destabilisieren Mutationen im kanonischen C-Loop von TAP1 das NBD-Dimer stärker als die äquivalenten Mutationen in TAP2. Folglich trägt die ATP-Bindungsstelle II (Walker A/B-Motiv von TAP2 und C-Loop von TAP1) mehr zur Dimerbildung bei als die ATP-Bindungsstelle I. Es wird vermutet, dass die TMD von ABC-Transportern während des katalytischen Zyklus Konformationsänderungen durchlaufen, wodurch die Substrataffinität stark verringert wird. Diese strukturelle Änderung erleichtert die Freisetzung des Substrats auf der gegenüberliegenden Seite der Membran. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde daher versucht, einen Zustand von TAP zu identifizieren, der induziert durch ATP-Bindung oder ATP-Hydrolyse eine erniedrigte Peptidaffinität aufweist. Da im TAP-Komplex ein solcher Zustand bisher nicht nachgewiesen werden konnte, wurden im Walker B-Motiv die sauren Aminosäuren Asp688 in TAP1 und Glu632 in TAP2 gegen Asparagin bzw. Glutamin ersetzt. Studien an anderen ABC-Transportern oder isolierten NBDs haben gezeigt, dass die Mutation der katalytischen Base zu einem Glutamin die ATP-Hydrolyse inhibiert und sich in Gegenwart von ATP ein stabiler NBD-Dimer bildet. Es wird postuliert, dass solch ein NBD-Dimer einen Übergangszustand im Transportzyklus von TAP mit stark erniedrigter Substratspezifität darstellt. Die Einzel- oder Doppelmutation der Aminosäuren Asp688 und Glu632 beeinflussen im Vergleich zum wt-TAP weder Expressionsrate noch Peptidaffinität. Überraschenderweise transportieren alle Mutanten Peptide. Selbst die Doppelmutanten, bei denen beide katalytischen Basen zu Asparagin oder Glutamin mutiert wurden, zeigten im Vergleich zu wt-TAP noch eine 30%ige Transportaktivität. Auch bei diesen Mutanten ist der Peptidtransport von der ATP-Hydrolyse abhängig, da divalente Kationen einen essentiellen Kofaktor darstellen. Daher scheint zumindest in TAP das katalytische Wassermolekül nicht nur durch die postulierte Base sondern auch durch andere Aminosäureseitenketten polarisiert werden zu können. Die Hydrolyse des ATPs und nicht die Dimerisierung der Motordomänen liefert die Energie für den Peptidtransport, da bei diesen TAP-Mutanten unter Bedingungen, unter denen ATP-Hydrolyse nicht möglich ist, durch Zugabe von ATP keine Änderung der Peptid-Affinität festgestellt werden konnte.
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Metadaten
Author:Min Chen
URN:urn:nbn:de:hebis:30-0000004590
Referee:Robert Tampé
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2004
Year of first Publication:2004
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2004/07/12
Release Date:2004/10/27
Pagenumber:127
HeBIS PPN:124335276
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

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