Kryoimmunelektronenmikroskopische Lokalisierung synaptischer Proteine in Nervenendigungen und astrozytären Zellen

Cryoimmunoelectron microscopic localization of synaptic proteins in nerve terminals and astrocytic cells

In the present study the cryo-immunogold technique was used and optimized for investigating the ultrastructure and immunolabeling of synaptic proteins. It is evidently a suitable method for the localization of membrane p
In the present study the cryo-immunogold technique was used and optimized for investigating the ultrastructure and immunolabeling of synaptic proteins. It is evidently a suitable method for the localization of membrane proteins since the antigens are not treated with any chemical denaturation before immunolabeling except for the fixation and since the antigens are directly exposed to the surface of the cryo-ultrasections. The v-SNARE VAMP II and the vesicle-associated proteins SV2 and Rab3A were detected extensively at small vesicles in the mossy fiber terminals. The t-SNARE SNAP-25, and N-type and P/Q type Ca2+ channels were allocated to the plasma membrane both at the active zone and outside the active zone. SNAP-25 and N-type Ca2+ channels appeared also at synaptic vesicles. A significantly increased immunolabeling of VAMP II, SV2, Rab3A, SNAP-25 and N-type Ca2+ channels was found at the active zones of fast synapses, indicating a concentration of these proteins at sites of exocytosis. The widespread distribution of the t-SNARE SNAP-25 at the axonal plasma membrane reveals that membrane-targeting specificity cannot be determined solely by v/t-SNARE interactions. Additional control components are required to assure the docking and exocytosis of the synaptic vesicles at active zones. The novel protein Bassoon was only found at active zones of central synapses and showed the highest specific labeling among all proteins investigated. Its labeling pattern implies an association of Bassoon with the presynaptic dense projections, the structural guide for vesicle exocytosis. The involvement of Bassoon in the organization of the neurotransmitter release site suggests that Bassoon may play an important role in determining the specificity of vesicle docking and fusion. In the neurosecretory endings of neurohypophysis the synaptic proteins VAMP II, SNAP- 25, SV2, Rab3A, and the N-type Ca2+ channels showed a preferential labeling over microvesicles. Moreover, the immunolabeling intensity of these proteins over microvesicles corresponded closely to that over synaptic vesicles. This suggests that these synaptic proteins share an identical association with synaptic vesicle and microvesicles. A significant labeling of SNAP-25, the N-type Ca2+ channels and VAMP II was also detected at the plasma membrane near the clustered microvesicles, indicating the competence of microvesicles for docking and exocytosis along the plasma membrane in the absence of active zones. No significant labeling of VAMP II, SNAP-25, SV2 and N-type Ca2+ channel was observed at the membrane of neurosecretory granules. This is in agreement with the notion that synaptic vesicles and microvesicles possess regulatory mechanisms for exocytosis different from those of granules. In contrast, a/ß-SNAP and NSF were found on the granules, and Rab3A and the P/Q-type Ca2+ channels on granules in a subset of terminals. Rab3A is associated specifically with the oxytocin-containing granule population. Interestingly, some plasma membrane proteins, such as SNAP-25 and even N-type Ca2+ channels and P/Q-type Ca2+ channels, were observed not only at the plasma membrane but also at the vesicular organelles. This suggests that these vesicular organelles may be involved in transporting newly synthesized proteins from the soma to the plasma membrane of the terminal. Furthermore, the vesicular pool of the Ca2+ channels may serve in the stimulationinduced translocation into the plasma membrane when required. Using the conventional preembedding method with Epon and the post-embedding method with LR Gold, VAMP II was localized at vesicular organelles of varying size and on horseradish peroxidase filled endocytic organelles in cultured astrocytes, with and without stimulation in the presence of the horseradish peroxidase. This indicates that VAMP II is involved in the cycle of vesicular exocytosis and endocytosis in astrocytes. U373 cells are capable of expressing all three members of the synaptic SNARE complex (v-SNARE VAMP II, t-SNARE syntaxin I and SNAP25). This indicates the competence of U373 to carry out regulated exocytosis by means of the classical SNARE mechanism. In addition, the ubiquitous v-SNARE cellubrevin and the endosome-associated small GTPbinding protein Rab5 could be expressed in U373 cells. All recombinant synaptic proteins investigated in U373 cells revealed a punctuate cellular distribution under the fluorescence microscope, suggesting that they are mainly associated with intracellular compartments. The cryo-electron microscopy provided direct evidence for the association of all expressed proteins with electron-lucent vesicular organelles. It further supports the potential of U373 MG cells to release low molecular weight messengers by a regulated exocytosis mechanism. In addition, myc-VAMP II was found on dispersed granules. Probably, VAMP II also participates in the exocytosis event of granules in U373 cells. Gold labeling for the two presumptive t-SNAREs syntaxin I and SNAP-25 in U373 cells was confined to the vesicular organelles. At the ultrastructural level no significant labeling was identified at the plasma membrane. The high level of colocalization of the two SNARE proteins VAMP II and syntaxin I in the cell body and in cell processes suggests that the two proteins are mostly sorted into identical vesicular organelles. A partial colocalization of VAMP II and cellubrevin as well as of VAMP II and Rab5 was observed under the fluorescence microscope. At the ultrastructural level, a colocalization of VAMP II and cellubrevin as well as of VAMP II and Rab5 was found on some clustered vesicles. The partial colocalization of VAMP II and cellubrevin implies that they similarly function as v-SNAREs. The partial colocalization of Rab5 with VAMP II in U373 cells suggests that the endosomal protein Rab5 is associated with VAMP II-containing organelles during some stages of their life cycle.
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Die Freisetzung von Neurotransmittern aus kleinen synaptischen Vesikeln schneller Synapsen hängt von dem koordinierten Zusammenwirken spezifischer Vesikelproteine ab. Genetische, physiologische und biochemische Untersuch
Die Freisetzung von Neurotransmittern aus kleinen synaptischen Vesikeln schneller Synapsen hängt von dem koordinierten Zusammenwirken spezifischer Vesikelproteine ab. Genetische, physiologische und biochemische Untersuchungen legen nahe, dass sich viele synaptische Proteine - einschließlich der Mitglieder der SNARE-Familie - an den Exozytose-Prozessen der synaptischen Vesikel beteiligen. Die genauen molekularen Mechanismen der Vesikel-Exozytose sind jedoch weitgehend unbekannt. Es fehlen außerdem eindeutige morphologische Nachweise der bevorzugten Lokalisation dieser Proteine an den aktiven Zonen des Synapsen, die ihre Assoziation mit der schnellen Neurotransmitter- Freisetzung in situ zeigen könnten. Die fundamentalen Mechanismen des "membrane traffic" gelten bei allen eukaryotischen Zellen als phylogenetisch konserviert. Dies bedeutet, dass ähnliche Proteine für die Kontrolle der Membranfusion sowohl bei Neuronen als auch bei anderen nicht-neuralen Zellen benutzt werden können. Wie zahlreiche jüngere Untersuchungen zeigen, können Astrozyten ihre Botenstoffe mittels eines Neuronenähnlichen sekretorischen Prozesses freisetzen. Dabei wird vermutlich eine regulierte Vesikel- Exozytose und besonders der klassische SNARE-Mechanismus in den Sekretionsprozess miteinbezogen. Allerdings gibt es für den Vesikelzyklus bei Astrozyten kaum morphologische Nachweise für die Funktion der Exozytose-relevanten Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurden daher die Lokalisation von SNARE-Proteinen sowie anderen Vesikel-relevanten Proteinen an zwei unterschiedlichen Nerventerminalen sowie bei astrozytären Zellen mittels Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie untersucht. Ziel dieser Arbeit ist es, ein besseres Verständnis der Funktion dieser Proteine bei der Freisetzung der Botenstoffe zu erhalten. 1. Lokalisation der synaptischen Proteine an zwei unterschiedlichen Typen von Nervenendigungen Zum morphologischen Nachweis der verschiedenen synaptischen Proteine wurde die Methode der Immungoldmarkierung an ultradünnen Kryoschnitten angewendet. Untersucht und analysiert wurden die Lokalisation und die Verteilung dieser synaptischen Proteine an (1) den großen Moosfaserendigungen mit vielen aktiven Zonen in der hippocampalen CA3 Region, und an (2) den neurosekretorischen Terminalen ohne spezielle Freisetzungsstellen in Neurohypophyse. Hier war besonders von Interesse, ob SNARE-Proteine vorzugsweise mit aktiven Zonen in den schnellen Synapsen verbunden sind, und inwieweit die Lokalisation dieser Proteine in solchen Endigungen, die keine definierten Freisetzungsstellen besitzen, von denjenigen in den synaptischen Terminalen verschieden sind. In den hippokampalen Moosfaserendigungen wurden das v-SNARE VAMP II und die weiteren Vesikel-gebundenen Proteine SV2 und Rab3A umfassend an den synaptischen Vesikeln lokalisiert. Das t-SNARE SNAP-25, und N- und P/Q-Typ Ca2+-Kanäle ließen sich an der Plasmamembran in und außerhalb der aktiven Zone nachweisen. SNAP-25 und N-Typ Ca2+-Kanäle wurden auch an synaptischen Vesikeln gefunden. Die quantitative Analyse zeigte eine deutlich erhöhte Immunmarkierung von VAMP II, SV2, Rab3A, SNAP-25, und N-Typ Ca2+-Kanäle an den aktiven Zonen. Dies deutet auf eine direkte Teilnahme solcher Proteine an der Exozytose von synaptischen Vesikeln in den schnellen zentralen Synapsen. Besonders die Markierung von VAMP II und SNAP-25 dicht an den angedockten synaptischen Vesikeln und an der Plasmamembran in aktiven Zonen weist auf eine Assoziation von diesen Proteinen mit dem präsynaptischen Docking-Komplex hin. Der Nachweis von N-Typ und P/Q-Typ Ca2+-Kanäle an den aktiven Zonen liefert einen morphologischen Beleg für ihre Beteiligung an der Regulierung der schnellen Neurotransmission. Er unterstützt auch die Hypothese, dass diese beiden Ca2+-Kanäle mit dem SNARE-Komplex interagieren können. Die breite Verteilung von SNAP-25 an der axonalen Plasmamembran weist darauf hin, dass seine Funktion nicht wesentlich für die Positionierung der Freisetzungsstelle von synaptischen Vesikeln sein dürfte. Die Docking-Spezifität der Vesikel wird nicht nur durch die v/t- SNARE-Interaktion definiert. Zusätzliche kontrollierende Faktoren sind folglich erforderlich, um "docking" und Exozytose der synaptische Vesikel an der aktiven Zone zu gewährleisten. Das hochmolekulare Protein Bassoon war hauptsächlich an den aktiven Zonen der zentralen Synapsen zu finden. Direkt auf der Plasmamembran waren jedoch keine Markierungen nachzuweisen. Das Verteilungsmuster deutet auf eine Assoziation von Bassoon mit den "presynaptic dense projections" hin. Die Einbeziehung von Bassoon in die Organisation des Freisetzungsortes von Neurotransmittern verdeutlicht, dass dieses Protein eine wichtige Rolle bei der Definition der Spezifität für "docking" und Fusion der synaptischen Vesikeln spielt. In den neurosekretorischen Endigungen der Neurohypophyse zeigten die synaptischen Proteine VAMP II, SV2, Rab3A, SNAP-25, und die N-Typ Ca2+-Kanäle eine bevorzugte Markierung auf Mikrovesikeln. Die Intensität der Immunmarkierung dieser Proteine auf den Mikrovesikeln entspricht derjenigen von synaptischen Vesikeln. Dieses deutet darauf hin, dass diese synaptischen Proteine eine identische funktionelle Bedeutung auf synaptischen Vesikeln und Mikrovesikeln besitzen. Die vorliegende Untersuchung stützt damit die Hypothese, dass die Mikrovesikel nicht nur bezüglich ihrer Größe und ihrer Morphologie denen typischer synaptischer Vesikel ähnlich sind, sondern auch ähnliche Eigenschaften wie diese haben. Eine starke Markierung von SNAP-25, N-Typ Ca2+-Kanäle sowie von VAMP II ließ sich auch an der Plasmamembran nahe der Mikrovesikel-Cluster nachweisen. Dies läßt vermuten, dass Mikrovesikel die Kompetenz zum "docking" und zur Exozytose entlang der Plasmamembran besitzen, auch wenn eine aktive Zone fehlt. Die aus den Mikrovesikeln freigesetzten Botenstoffe könnten als lokale regulierende Faktoren verwendet werden, um die Sekretion an neurohypophysären Endigungen zu koordinieren. An den neurosekretorischen Granula konnten Markierungen von VAMP II, SV2, SNAP-25, und N-Typ Ca2+-Kanäle nicht nachgewiesen werden. Dies entspricht der Vorstellung, dass Granula, verglichen mit Mikrovesikeln und synaptischen Vesikeln, unterschiedliche Mechanismen für die Exozytose besitzen. Allerdings wurden a/ß-SNAP und NSF auf den Granula nachgewiesen, und ebenso Rab3A und P/Q-Typ Ca2+-Kanäle auf den Granula einer Subpopulation von neurohypophysären Terminalen. Rab3A war mit Oxytocin-Granula spezifisch assoziiert, wie durch die Doppelmarkierung gezeigt werden konnte. Die Markierungen von a/ß-SNAP an der Plasmamembran und am Verbindungsstiel des Granulums mit der Plasmamembran lassen vermuten, dass a/ß-SNAP an die Regulierung der Exozytose der neurohypophysärer Granula mitbeteiligt ist. Die Markierungen für a/ß-SNAP und NSF auf den Granula unterstützen die Hypothese, dass vesikuläre Organellen beide Proteine zum Exozytoseort transportieren können. Möglicherweise können diese Proteine ihre Funktion bereits vor dem Vesikeldocking ausüben. Außerdem zeigte keine der untersuchten Proteine eine konzentrierte Markierung an spezifischen Domänen der Plasmamembran der neurohypophysären Endigungen. Auch diese Ergebnisse machen deutlich, dass in den neurohypophysären Endigungen ein definierter Freisetzungsort fehlt. Offensichtlich entsprechen die Unterschiede bezüglich der Verteilung der untersuchten Proteine in den beiden Nerventerminalen auch den spezifischen Funktionseigenschaften dieser Proteine, was wiederum in hohem Maße mit den spezifischen Funktionseigenschaften der beiden Nerventerminalen selbst korrespondiert. Interessanterweise konnten einige Plasmamembranproteine, wie SNAP-25, sogar N- und P/QTyp Ca2+-Kanäle, nicht nur auf der Plasmamembran sondern auch auf vesikulären Organellen lokalisiert werden. Vermutlich sind diese vesikulären Organellen am Transport von neu synthetisierten Proteinen vom Soma bis zur Plasmamembran in den Nervenendigungen beteiligt. Weiterhin wurde vorgeschlagen, dass SNAP-25 zusammen mit den synaptischen Vesikeln in den Terminalen rezirkuliert wird, um sie dann zu reaktivieren. Der vesikuläre Vorrat an Ca2+-Kanälen könnte wiederum der stimulationsabhängigen Translokation in die Plasmamembran dienen. 2. Lokalisation der Vesikel-relevanten Proteine in astrozytären Zellen Um die Funktion von synaptischen Proteinen in astrocytären Zellen zu verstehen, wurde die subzelluläre Lokalisation von den Proteinen auf vesikulären Organellen sowie auf den durch Stimulation induzierten endozytotischen Kompartimenten an kultivierten kortikalen Astrozyten von neonatalen Ratten nachgewiesen. Zusätzlich wurden die Expression und die Lokalisation vieler Proteine, die für eine regulierte Exozytose und die interzelluläre Membranfusion verantwortlich sind, an Zellen aus einer permanenten Astrozytoma-Zellinie (U373 MG) untersucht. Verschiedene Konstrukte, die für die Proteine und die relevanten zusätzlichen Tags kodieren, wurden transient in diese Zellen transfiziert. Die Lokalisation der exprimierten rekombinanten Proteine wurde anschließend mittels Immunfluoreszenz und Kryo-Immunelektronmikroskopie nachgewiesen. Das Ziel war es, die sekretorischen Charakteristika der U373 MG Zellen aufzuklären sowie zu prüfen, ob diese Zell-Linie als effektives experimentelles Modell zur weiteren Studie des astrozytären Exozytose- Mechanismus genutzt werden kann. In kultivierten Astrozyten konnte VAMP II an elektronenlichten vesikulären Organellen variierender Größe sowie an mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) gefüllten endozytotischen Organellen - mit oder ohne Stimulation in Anwesenheit von HRP - sowohl mittels der Präembedding-Methode als auch mittels der LR Gold Postembedding-Methode nachgewiesen werden. Daraus folgt, dass in Astrozyten VAMP II am Zyklus der vesikulären Exo- und Endozytose beteiligt wird. U373 MG Zellen konnten alle drei Mitglieder des synaptischen SNARE-Komplexes (v- SNARE VAMP II, t-SNARE Syntaxin I, und SNAP-25) exprimieren. U373 MG Zellen sind folglich fähig, eine regulierte Exozytose mittels des klassischen vesikulären SNARE-Mechanismus durchzuführen. Zusätzlich konnten auch das ubiquitär vorhandene v-SNARE Cellubrevin und das Endosomen-assoziierte kleine GTP-bindende Protein Rab5 in den U373 MG Zellen exprimiert werden. Alle exprimierten rekombinanten Proteine zeigten in den U373 MG Zellen fluoreszenzmikroskopisch eine punktuelle zelluläre Verteilung. Vermutlich sind diese Proteine vor allem mit intrazellulären Kompartimenten assoziiert. Elektronenmikroskopisch zeigten sich in U373 MG Zellen zahlreiche vesikuläre Organellen. Den direkten Nachweis für eine Assoziation dieser Proteine mit den hellen Vesikeln lieferte der immunzytochemische Nachweis aller exprimierten Proteine an ultradünnen Kryoschnitten. Diese Daten weisen vor allem auf das Potential der U373 MG Zellen hin, niedermolekulare Botenstoffe mittels einer regulierten Exozytose freizusetzen. Die Kryoelektronen-Mikroskopie zeigte außerdem, dass myc-VAMP II in größerer Menge als die anderen untersuchten Proteine in U373 MG Zellen exprimiert wurden. Verschiedene Typen vesikulärer Organellen wurden intensiv mit myc-VAMP II markiert. Besonders auffallend sind dichte Markierungen auf zahlreichen kleinen Vesikeln, tubulovesikulären Organellen sowie der Plasmamembran. Vermutlich ist myc-VAMP II am Recycling von hellen vesikulären Organellen mitbeteiligt. Auch Granula sind mit myc-VAMP II markiert. Dies bedeutet, dass sich dieses Protein in den U373 MG Zellen auch an der Exozytose der Granula beteiligen kann. Die massive Expression von myc-VAMP II an multivesikulären Körpern und Lysosomen läßt sich wahrscheinlich auf überexprimiertes rekombinantes Protein zurückführen, das schließlich degradiert wird. Diese vielfältige VAMP II Markierung in U373 MG Zellen weist darauf hin, dass dieses Protein an den verschiedenen Stadien des Vesikelrecyclings beteiligt ist. Die hohe Kolokalisation der zwei SNARE-Proteine VAMP II und Syntaxin I im Zellkörper und in den Zellfortsätzen weist darauf hin, dass beide Proteine in der Regel in identische vesikuläre Organellen sortiert werden. Die teilweise Kolokalisation von VAMP II mit Cellubrevin an den hellen Vesikeln deutet auf eine ähnliche Funktion der beiden v-SNAREs hin. GFP-Rab5 ließ sich an hellen Vesikeln und Endosomen nachweisen. Vermutlich ist Rab5 sowohl in das Vesikelrecycling als auch in die Endosomenfusion der U373 MG Zellen involviert. Die teilweise Kolokalisation von Rab5 mit VAMP II an den hellen Vesikeln weist darauf hin, dass das endosomale Protein Rab5 während einiger Stadien seines Lebenszyklus mit den VAMP II-enthaltenen Organellen verbunden ist. Ähnlich wie bei den kultivierten Astrozyten konnten bei U373 MG Zellen keine eindeutigen Freisetzungsorte, wie eine neuronale aktive Zone, nachgewiesen werden. Auch kleine gedockte Vesikel sind in definierten Zellbereichen nicht zu finden. Überdies ähnelt das Expressionsmuster der untersuchten Proteine dem über lange Zeit kultivierter primärer Astrozyten. Die Markierung für die beiden mutmaßlichen t-SNARE Syntaxin I und SNAP-25 fand sich auf vesikulären Organellen. Die Plasmamembran der U373 MG Zellen zeigte keine signifikante Markierung. Diese Befunde legen nahe, dass U373 MG Zellen ihre Botenstoffe über einen ähnlichen Sekretionsmechanismus wie Astrozyten freisetzen. Sie können daher als geeignetes Model für weitere Untersuchungen des astrozytären Exozytosemechanismus eingesetzt werden.
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Metadaten
Author:Lixia Zhang
URN:urn:nbn:de:hebis:30-0000003708
Referee:Herbert Zimmermann
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2004/03/24
Year of first Publication:2004
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2004/01/15
Release Date:2004/03/24
Tag:Aktive Zone; Bassoon; Neurohypophyse; SNARE; Synaptisches Protein
HeBIS PPN:119688409
Institutes:Biowissenschaften
Dewey Decimal Classification:610 Medizin und Gesundheit
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

$Rev: 11761 $