Open Access

Bianca Eisel

• F1Fo ATP synthases are important membrane-embedded nano-machines which are conserved among all three kingdoms of life. They use a proton or sodium gradient across the membrane to drive ATP synthesis, which is the major source of energy for the cell. As ATP synthases are essential for pathogens such as mycobacteria, they are important drug targets for the treatment of infectious diseases. In this work, structural studies on the E. coli ATP synthase are performed. Furthermore, bacterial virulence MgtC proteins are investigated. Additionally, photo-switches are used to spatiotemporally control yeast ATPase activity...
• Die ATP Synthase repräsentiert eine molekulare Nanomaschininerie, die wichtig ist für den Energiemetabolismus aller lebenden Zellen. Besonders die bakteriellen ATP Synthasen sind in den Fokus der Forschung geraten, da sie wie zum Beispiel die mykobakterielle ATP Synthase als drug target in pathogenen Bakterien genutzt werden können. Deshalb ist es essentiell, hochauflösende Strukturen von bakteriellen ATP Synthasen zu erlangen, um mögliche Inhibitoren entwickeln zu können. Für strukturelle Untersuchungen von Proteinen ist deren Reinheit Voraussetzung. In diesem Projekt wurde angestrebt, die E. coli ATP Synthase zu zu reinigen und ihre Stabilität in unterschiedlichen Puffern (pH Werten), Detergenzien sowie Reinigungsprozeduren zu testen. Hierzu sollte auch die Rekonstitution der E. coli ATP Synthase in eine Lipidumgebung etabliert werden. Des Weiteren war die Strukurauflösung der E. coli ATP Synthase ein Ziel dieses Projekts. Zur Stabilitätsprüfung wurden In-Gel-Aktivitätsassays und Thermophorese verwendet. Die Lipidumgebung sollte mittels Rekonstitution in Proteoliposomen, Nanodiscs und Saposinpartikel geschaffen werden, um folgend Strukturuntersuchungen mittels EM durchzuführen. Die Reinigung der E. coli ATP Synthase konnte optimiert werden und die Enzymstabilität war in Puffern mit pH-Wert 7, sowie dem milden Detergenz PCC und der Reinigungsprozedur Solibilisierung in PCC, PEG Fällung, NiAffinitätschromatographie und Größenausschlusschromaographie am Besten. Die Rekonstitution in Proteoliposomen, Nanodiscs, wie auch Saposinpartikel wurde etabliert. Die Nanodiscs, wie auch Saposinproben, waren durch ihre hohe Reinheit geeignet für EM Studien. Diese zeigten für die E. coli ATP Synthase rekonstitutiert in Nanodiscs definiertere Dichten als für die Saposinprobe, vermutlich durch weniger Flexibilität. In der 3D Struktur der ATP Synthase rekonstitutiert in Nanodiscs sind die Untereinheiten des F1 Kopfes, sowie der äußere und der innere Stalk sehr gut erkennbar. Diese Studien legen die Grundlage für die Optimierung der Nanodiscprobe für Kryo-EM. ...