Open Access

Thea Leandra Golisch

• The genetic mutation of the coagulation factor VIII (fVIII) results in a defective or missing protein, leading to a malfunctioning blood coagulation. The resulting disease is called hemophilia A. Depending on the severity of the mutation, affected patients experience an increased risk of pathologic bleeding after minor trauma or even sudden bleeding events. Substitution therapies with extrinsic fVIII exist using plasmatic or recombinant fVIII products. Due to an insufficient immune tolerance towards substituted fVIII, about 30 % of patients develop allogenic neutralizing antibodies (inhibitors) against substituted fVIII products. The gold standard of treating inhibitors is the immune tolerance induction (ITI), where patients are given frequent, high doses of fVIII to induce an immune tolerance. ITI therapy fails in about 30 % of patients. Mechanisms of action of ITI are part of research, as insufficient knowledge about mechanisms and prognostic factors complicate treatment. For example, the development of anti-idiotypic antibodies, which occur naturally as a regulatory mechanism of the immune system, are being studied. Such anti-idiotypes have been detected in immunoglobuline preparations and in patients after successful ITI. Inhibitors interfere with fVIII function in coagulation by binding functional epitopes within fVIII domains. Inhibitors against the A2 and C2 domain are predominantly found, however also the C1 domain has been shown to be highly immunogenic in some patients. The polyclonality of inhibitors aggravates the understanding and treatment of these. The present project therefore focusses on the selection of synthetic anti-idiotypic antibodies to target inhibitors in patients. The phage display method was applied to, for one, isolate anti-idiotypic single chain variable fragments (scFvs) specific against human polyclonal anti-fVIII antibodies and second against two C1 domain-specific inhibitory monoclonal antibodies (mAbs). In the first project, anti-fVIII antibodies were purified from human plasma to serve as target molecules. A previous project showed that using full plasma as a target did not yield anti-idiotypic antibodies from phage display. For the purification, protein A chromatography and fVIII coupled Affi Gel® chromatography were applied. The isolated antibodies were next used as targets for the selection of anti-idiotypic scFvs. Analysis revealed that none of the selected phages solely bound the anti-fVIII antibody target. Consequently, the test protocol was modified, which resulted in a reduction of unspecific binders. Yet, no target-specific binders were isolated from phage pools. Reason for this may have been the high diversity of the polyclonal antibody target and the limited diversity of the phage libraries. The aim of the second project, was the selection and characterization of scFvs, that target the paratopes of C1 domain-specific mAbs GMA8011 and LE2E9. From a therapeutic viewpoint, the preparation of an anti-idiotypic antibody pool, tailored to each patient’s inhibitor population, could help neutralize inhibitors in patients. Ultimately, one GMA8011-specific scFv-carrying phage clone (H2C1) and two specifics to LE2E9 (H3G7, H3F10) were isolated. In further experiments, only the GMA8011-specific scFv showed competitive behavior in presence of fVIII, pointing towards an anti-idiotypic binding to the inhibitor paratope. The LE2E9-specific scFvs did not prevent binding of the inhibitor to fVIII. Hence, no anti-idiotypic behavior could be determined. For further characterization, selected scFvs were genetically fused to Fc antibody fragments and recombinantly produced. In this antibody format, all three scFvs showed concentration dependent binding to the target and the isotype control. The binding specificity to the target, observed in phage context, could not be reproduced. Competition experiments with fVIII confirmed that none of the scFvs bound the paratope of their target inhibitor. The selection of anti-idiotypic scFvs from phage display libraries proves to be effortful. Polyclonal anti-fVIII antibodies purified from hemophilic plasma appear to be unsuitable as a target for phage display, likely due to the high diversity of the target molecules. Furthermore, the preparation of an individualized anti-idiotypic pools for patients by selecting scFvs against single inhibitory mAbs proves to be difficult. The selection of scFvs against anti-C1 inhibitors GMA8011 and LE2E9 produced three promising scFv-carrying phages. However, analysis could not detect anti-idiotypic behavior. Further research with inhibitors, monoclonal and polyclonal, and anti-idiotypic antibodies should be performed to bring better insight into the highly complex paratope-epitope interaction.
• Hämophilie A, ausgelöst durch eine Mutation im Gen des Gerinnungsfaktors VIII (fVIII), führt zu einer verzögerten Gerinnung und Spontanblutungen in Patienten. Je nach Ausprägung der Mutation ist fVIII funktionsgemindert oder funktionsunfähig. Therapeutisch lässt sich fVIII in Form eines plasmatischen oder rekombinanten Präparats substituieren. Aufgrund einer unzureichenden Immuntoleranz gegenüber dem substituierten fVIII entwickeln circa 30% der Patienten allogene neutralisierende Antikörper (Inhibitoren) gegen den Faktor. Als Erstlinientherapie gegen Inhibitoren wird eine Immuntoleranzinduktion (ITI) durch hochdosierte fVIII Gabe eingesetzt. Die ITI führt bei etwa 30% der Patienten nicht zum Therapieerfolg. Wirkmechanismen der ITI sind Gegenstand der Forschung, da die unzureichende Kenntnis über Mechanismen und prognostische Faktoren der ITI die Behandlung verkomplizieren. Unter anderem wird die Bildung von anti-idiotypischen Antikörpern erforscht, welche als natürliche Regulatoren des Immunsystems vorkommen. Sie wurden unter anderem in Immunglobulinpräparaten und in Patientenplasma nach erfolgreicher ITI detektiert. Durch Bindung funktioneller Epitope innerhalb der fVIII-Domänen beeinträchtigen Inhibitoren die Funktion von FVIII innerhalb der Gerinnungskaskade. Inhibitoren gegen die A2- und C2-Domäne kommen gehäuft vor, aber auch die C1-Domäne trägt signifikant zur Immunogenität des fVIII bei. Die Polyklonalität der existierenden Inhibitoren erschwert eine gezielte Therapie. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Generierung von Anti-Idiotypen zur Eliminierung von Inhibitoren. In diesem Rahmen wurde die Phage-Display-Technologie angewandt, um spezifische single chain variable fragments (scFv) gegen humane polyklonale anti fVIII Antikörper aus Patientenplasma und gegen zwei monoklonale C1 Domänen spezifische Antikörper zu selektieren. Da in vorherigen Experimenten mit Inhibitor-haltigem Vollplasma keine erfolgreiche Selektion von Anti-Idiotypen möglich war, wurden im ersten Projekt dieser Arbeit anti-fVIII-Antikörper aus humanem Plasma aufgereinigt. Hierzu wurden Protein A Chromatographie und fVIII gekoppelte Affi Gel® Affinitätschromatographie angewandt. Dabei wurden fVIII-spezifische Antikörper erfolgreich aufgereinigt. Die isolierten anti-fVIII Antikörper wurden im Anschluss als Zielmoleküle für die Selektion von Anti-Idiotypen eingesetzt. Bei der Analyse selektierter scFv-tragender Phagen zeigte sich, dass keiner der Phagen alleinig die fVIII-spezifischen Antikörper band, sondern auch die unspezifische IgG-Kontrolle. Das Selektionsprotokoll wurde daraufhin angepasst, was zu einer Reduktion von unspezifischen Bindern führte. Jedoch konnten auch hier keine anti-idiotypischen Phagen gegen fVIII-spezifische Antikörper selektiert werden. Grund hierfür war möglicherweise die hohe Variabilität der polyklonalen Antikörper und die eingeschränkte Vielfalt der Phage Display Bibliotheken. Im zweiten Teil dieser Arbeit verfolgten wir die Selektion von anti-idiotypischen scFvs, die sich gezielt gegen die C1-Domänen-spezifischen monoklonalen Antikörper GMA8011 (murin) und LE2E9 (human) richten. Aus therapeutischer Sicht könnte ein individuelles Anti-Idiotypengemisch dazu verwendet werden gezielt Inhibitoren in Patienten zu neutralisieren. Hierbei konnten ein GMA8011-spezifischer (H2C1) und zwei LE2E9-spezifische (H3G7, H3F10) scFv-tragende Phagen isoliert werden. In weiteren Experimenten zeigte nur der GMA8011-spezifische scFv ein kompetitives Bindungsverhalten in Gegenwart von fVIII, was auf eine anti-idiotypische Bindung an das Inhibitorparatop hindeutet. Die LE2E9-spezfischen scFvs konnten die Bindung von LE2E9 an fVIII nicht verhindern. Somit ließ sich hier kein anti-idiotypisches Verhalten feststellen. Für weitere Charakterisierungsschritte wurden die scFvs in den Antikörperkontext (scFv-Fc) kloniert und rekombinant hergestellt. Im Antikörperkontext zeigten alle drei scFvs eine konzentrationsabhängige Bindung an den Zielantikörper sowie die Isotypen-Kontrolle. Die Bindespezifität aus dem Phagenkontext konnte nicht reproduziert werden. Dass bei keinem der drei scFvs eine Bindung an das Paratop des Zielantikörpers vorliegt, bestätigte sich in Kompetitionsexperimenten mit fVIII. Die Selektion fVIII Inhibitor neutralisierender Antikörper erweist sich als anspruchsvoll. Aufgereinigte anti-fVIII-Antikörper aus Patientenplasma als Zielmolekül im Biopanning einzusetzen führte zu keinem Erfolg, möglicherweise durch die zu große Diversität der Zielmoleküle. Die Generierung eines monoklonalen Anti-Idiotypengemischs zur gezielten Therapie einzelner Patienten erweist sich als mühsame Methode. Wir konnten Inhibitor-bindende scFvs gegen LE2E9 und GMA8011 selektieren, in Analysen jedoch kein anti-idiotypisches Verhalten nachweisen. Die hohe Spezifität der Bindung des Inhibitorparatops an das Zielepitop, welches sich auf wenige Aminosäurereste beschränkt, fordert eine ebenso spezielle Beschaffenheit des Anti-Idiotypen, welche in den untersuchten Phagenbibliotheken nicht gefunden werden konnte. Weitere Versuche mit monoklonalen Inhibitoren und Anti-Idiotypen sollen zu einem besseren Verständnis der Paratop-Epitop-Interaktion führen.