Ultrazentrifugen-Untersuchungen an integralen Membran-Proteinen : neue Techniken zur Dichtekompensation von Detergensmizellen und ihre Anwendung

Die analytische Ultrazentrifuge ist ein unverzichtbares Instrument zur Charakterisierung von schwachen Protein-Protein-Wechselwirkungen und deren funktioneller oder regulatori­scher Be­deutung. Eine besondere Gruppe von 
Die analytische Ultrazentrifuge ist ein unverzichtbares Instrument zur Charakterisierung von schwachen Protein-Protein-Wechselwirkungen und deren funktioneller oder regulatori­scher Be­deutung. Eine besondere Gruppe von Untersuchungs­objekten bilden die integralen Mem­bran­proteine, die für eine Ultrazentrifugenanalyse solubilisiert, d.h. aus ihrer natür­li­chen, hy­dro­phoben Um­ge­bung in wäßriges Milieu überführt werden müssen. Diese Aufgabe wird vom Standpunkt der Erhaltung des natürlichen Proteinzustands am bes­ten von nicht­ioni­schen Deter­genzien erfüllt, wobei das biochemisch optimale Detergens von Protein zu Pro­tein i.A. ver­schieden ist. Die notwendige Anwesenheit von Detergens wäh­rend der Zentrifu­gen­analyse belas­tet diese andererseits, da freies wie protein­gebun­denes Deter­gens zusätz­liche un­bekannte Größen darstellen. Diese Unbekannten können durch ex­pe­ri­mentelle Gleich­set­zung von De­ter­gens­dichte und Lösungsdichte eliminiert werden (Dich­te­kom­pen­sation). Die Mög­lich­kei­ten der etablierten Dichte­kom­pen­sations­ver­fah­ren sind allerdings beschränkt, ins­be­sondere Deter­genzien mit hoher Dichte sind damit nicht er­faß­bar - ein Man­gel, der manche Un­ter­su­chung be- oder verhindert. Aus diesem Grund wurden neue Dichtekompensationsverfahren entwickelt und bestehende verbessert bzw. erweitert: zum einen die Erhöhung der Lösungsdichte durch Zusatz von Sac­cha­rose, Glyzerin oder einer Sac­charose-D2O-Kombination, zum anderen die Anpassung der Detergensdichte durch Mi­schen von Detergenzien mit niedriger und mit hoher Dichte. Die neuen Verfahren wurden über­prüft, indem ein integrales Mem­bran­pro­tein mit bekannten Eigenschaften, Cytochrom c-Oxi­da­se von Paracoccus denitri­fi­cans, unter Anwendung sowohl der neuen Verfahren als auch der etablierten D2O-Methode im Sedimentations­gleichgewicht analysiert wurde. Der Ver­gleich der Ergebnisse zeigte zum einen die Äquiva­lenz der ver­schie­de­nen Methoden im Falle der Kompensation von Detergensdichten, die auf her­kömm­li­che Weise kompensier­bar sind, zum andern, daß nach Kompensation deutlich höherer Dich­ten das partial­spezifi­sche Volu­men des Proteins zu korrigieren ist. Eine derartige Korrektur wurde nötig beim Vorhaben, den oligomeren Zustand des Cyto­chrom bc1-Kom­plexes von Paracoccus denitrificans zu bestimmen, da dieses Atmungs­ket­ten­enzym nur in Gegenwart von DDM, einem Detergens mit hoher Dichte, stabil war. Die Un­sicher­heit, die sich aus der via Vergleich mit Cytochrom c-Oxidase durchgeführten Korrek­tur ergab, war nicht relevant, da sich der intakte bc1-Kom­plex in DDM-Lösung als ein­heit­li­che Substanz erwies und er damit ein "einfaches" Problem darstellte. Die Sedimentationsgleichgewichtsunter­suchung des Proteins unter der Bedingung der Dich­te­kom­pensation ergab nach Berück­sichtigung des Korrekturterms, daß der solubili­sierte, en­zyma­­tisch aktive bc1-Kom­plex als Dimer vorliegt. Dieses Ergebnis korreliert mit der aktu­ellen Vorstellung von der Funktionsweise des Enzyms, derzufolge die dimere Form für den Elek­tro­nen­transfer notwendig ist. Komplizierter als der oligomere Zustand des bc1-Kom­plexes ist offenbar das Selbst­asso­ziati­ons­ver­halten des Bande 3-Proteins, des Anionenaustauschers aus der menschlichen Erythro­zy­ten­membran: Entgegen der vorherrschenden Meinung, eine in Detergenslösung vorliegende in­tak­te Bande 3 bilde stabile Dimere, weisen die vorliegenden Ergebnisse darauf hin, daß das so­lu­bilisierte Protein aus mehreren Oligomeren besteht. So zeigen die vorhandenen Daten ne­ben dimerer Bande 3 die Existenz von monomerem und tetramerem Protein, letztere Form ver­mut­lich in unterschiedlichen Zuständen, und verweisen auf ein Assoziations­gleich­gewicht zwischen den Oligomeren, vermutlich überlagert durch stabiles Dimer. Letzteres erscheint als "Grenz­fall" eines Bande 3-Präparats, der nach langer Lagerung und/ oder nach suboptimaler Be­hand­lung eintritt. Wegen der Komplexität des Bande 3-Verhaltens konnten die Zentrifugenuntersuchungen nur in Gegenwart von Detergenzien durchgeführt werden, deren Dichte eine Kompensation ohne Korrek­tur­bedarf zuläßt. Darüber hinaus kamen wegen der offensichtlichen Empfindlichkeit der Bande 3 nur sehr milde Detergenzien zum Einsatz: C12E9 und Triton X-100 (reduzierte Form). Aus selbigem Grund wurde die Detergensdichte bevorzugt mit Saccharose oder Gly­zerin kompensiert, deren proteinstabilisierende Wirkung bekannt ist.
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Metadaten
Author:Gottfried Mayer
URN:urn:nbn:de:hebis:30-0000002607
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2003/08/18
Year of first Publication:2002
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2002/09/23
Release Date:2003/08/18
HeBIS PPN:113200846
Institutes:Physik
Dewey Decimal Classification:530 Physik
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

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