NOSTRIN - ein neuer Interaktionspartner der endothelialen NO-Synthase

Stickstoffmonoxid (NO) ist ein gasförmiger Botenstoff, der über die Regulation des Vasotonus, die Hemmung der Thrombocytenaggregation sowie die Stimulation der Angiogenese auf die vaskuläre Homöostase einwirkt. Das wicht
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein gasförmiger Botenstoff, der über die Regulation des Vasotonus, die Hemmung der Thrombocytenaggregation sowie die Stimulation der Angiogenese auf die vaskuläre Homöostase einwirkt. Das wichtigste NO-produzierende Enzym im kardiovaskulären System ist die endotheliale NO-Synthase (eNOS), deren Aktivität durch posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung und Acylierung, durch Interaktionen mit regulatorischen Proteinen wie Ca2 /Calmodulin und Caveolin sowie durch differentielle subzelluläre Lokalisation reguliert wird. Dabei sind die Faktoren, welche die (Trans-)Lokation der eNOS zwischen subzellulären Kompartimenten wie den Caveolae der Plasmamembran und dem Golgi-Apparat dirigieren, weitgehend unbekannt. Zur Identifizierung neuer Interaktionspartner wurde humane eNOS im "yeast two-hybrid"-System als "Köderprotein" eingesetzt und dabei das Fragment eines neuen humanen Proteins identifiziert, das vorläufig NOSTRIN (für: eNOS traffic inducer) genannt wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit gelang nun die Klonierung der kompletten NOSTRIN-cDNA, der Nachweis einer spezifischen Interaktion von eNOS und NOSTRIN in Säugerzellen sowie die Charakterisierung von NOSTRIN als Modulator der subzellulären Lokalisation und Aktivität von eNOS. Nach der kompletten Klonierung der NOSTRIN-cDNA mit Hilfe einer 5'-RACE resultierte ein offenes Leseraster von 506 Aminosäuren entsprechend einer Größe von ca. 58 kDa für NOSTRIN. Eine Datenbankrecherche zum Vergleich der NOSTRIN-Sequenz mit Sequenzen bekannter Proteinmotive ergab die Vorhersage einer N-terminalen Cdc15-Domäne sowie einer C-terminalen SH3-Domäne. Die direkte Interaktion zwischen eNOS und NOSTRIN konnte durch Copräzipitation in vivo und in vitro bestätigt werden. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass die SH3-Domäne von NOSTRIN essentiell für die Bindung an eNOS ist. Zur Untersuchung des Einflusses von NOSTRIN auf die eNOS-Lokalisation wurden stabil transfizierte CHO-Zellen, die eNOS überexprimierten ("CHO-eNOS") eingesetzt. In der Immunofluoreszenz war eNOS vornehmlich in Assoziation mit der Plasmamembran und dem Golgi-Apparat zu sehen. Mit Hilfe des Semliki-Forest-Virussystems (SFV) wurde nun NOSTRIN transient überexprimiert; dabei zeigte sich für NOSTRIN eine vesikelartige Verteilung im Cytoplasma. Die NOSTRIN-Überexpression führte zu einer drastischen Umverteilung von eNOS, die nun in charakteristischen vesikelartigen Strukturen mit NOSTRIN colokalisierte. Die Verwendung von NOSTRIN-Konstukten, bei denen die SH3- Domäne deletiert war ("NOSTRIN.SH3"), veränderte zwar die typische NOSTRIN-Lokalisation nicht, ließ aber auch die subzelluläre Verteilung von eNOS unverändert, so dass NOSTRIN.SH3 und eNOS in unterschiedlichen zellulären Kompartimenten lokalisiert waren. Mit Hilfe der Immunofluoreszenz konnte ebenfalls eine Colokalisation von NOSTRIN und Caveolin-1, einem inhibitorisch wirkenden Interaktionspartner von eNOS, nachgewiesen werden. Die Analyse von Copräzipitationen mit NOSTRIN bzw. NOSTRIN.SH3 zeigte, dass Caveolin-1 in eNOS-unabhängiger Weise an NOSTRIN bindet, so dass ein ternärer Komplex aus NOSTRIN, eNOS und Caveolin-1 resultiert. Zur Klärung der Frage, ob NOSTRIN neben der subzellulären Lokalisation auch die Aktivität von eNOS beeinflusst, wurde die NO-Freisetzung von CHO-eNOS-Zellen analysiert. Dabei ergab sich, dass die transiente Überexpression von NOSTRIN in CHO-eNOS-Zellen die eNOS-Aktivität um 62 % im Vergleich zu Kontrollzellen reduzierte. In humanen primären Endothelzellen konnte mittels Immunoblotting und Immunofluoreszenzmikroskopie das Vorkommen von endogenem NOSTRIN sowie dessen Colokalisation mit endogener eNOS an der Plasmamembran nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation führen zur Hypothese, dass NOSTRIN als "molekulare Klammer" zwischen eNOS und Caveolin-1 dient, eine dynamische Umverteilung von eNOS innerhalb der Zelle vermittelt und damit das Enzym - direkt und/oder indirekt - inhibiert. Somit dürfte NOSTRIN als Modulator der Aktivität und Lokalisation von eNOS eine wichtige Rolle bei der Regulation der endothelialen NO-Produktion spielen.
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The activity of the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) is tightly regulated by changes in intracellular Ca2 -concentration, posttranslational modification and by interaction with proteins like caveolin and Hsp90. F
The activity of the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) is tightly regulated by changes in intracellular Ca2 -concentration, posttranslational modification and by interaction with proteins like caveolin and Hsp90. Following stimulation, eNOS cycles between plasma membrane caveolae and intracellular compartments, a process involving reversible acylation and specific protein-protein interactions, e.g. with the recently identified eNOS interacting protein, NOSIP. Nevertheless stimulus induced translocation of eNOS is yet controversial and the underlying mechanism still poorly understood. A novel eNOS binding protein previously identified in a yeast-two-hybrid (Y2H) screen using the eNOS oxygenase domain as bait, was cloned full length by application of 5'-RACE and subsequently termed NOSTRIN, meaning eNOS traffic inducer. NOSTRIN is a 58 kDa protein containing a N-terminal cdc15 and a C-terminal SH3 domain. Co-precipitation experiments confirmed the eNOS-NOSTRIN interaction both in vivo and in vitro and revealed that NOSTRIN's SH3 domain is essential for eNOS binding. Immunofluorescence studies showed that wild type NOSTRIN overexpressed in CHO-eNOS cells localized in punctuate cytoplasmic structures, whereas a deletion mutant lacking the cdc15 domain exhibited a more diffuse cytoplasmic distribution. Overexpression of NOSTRIN also caused eNOS localization to change dramatically from the plasma membrane-bound state to a vesicle-like distribution, matching the NOSTRIN pattern. Deletion of the NOSTRIN SH3 domain abolished colocalisation with eNOS, underscoring that this domain is the eNOS binding site. Furthermore the characteristic structures containing NOSTRIN and eNOS were also shown to colocalize with caveolin-1-rich intracellular vesicles. Co-precipitation of caveolin-1 with NOSTRIN and NOSTRIN.SH3 demonstrated a direct interaction between NOSTRIN and caveolin-1 which was independent of eNOS binding, thus suggesting the existence of a ternary complex containing NOSTRIN, eNOS and cavolin-1. Finally, measuring nitric oxide release showed that NOSTRIN caused a significant decrease in eNOS activity (62 %) when overexpressed in CHO-eNOS cells. Using immunoblotting and immunofluorescence microscopy endogenous expression of NOSTRIN has been shown in primary human endothelial cells where it co-localizes extensively with eNOS at the plasma membrane. Taken together these results suggest that NOSTRIN modulates the enzymatic activity and the subcellular localization of eNOS. Furthermore through interaction with caveolin-1 NOSTRIN might modulate the inhibitory interaction between caveolin-1 and eNOS.
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Metadaten
Author:Kirstin Zimmermann
URN:urn:nbn:de:hebis:30-0000002411
Referee:Werner Müller-Esterl
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2003/07/11
Year of first Publication:2002
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2002/12/20
Release Date:2003/07/11
HeBIS PPN:113409575
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:610 Medizin und Gesundheit
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

$Rev: 11761 $