Three dimensional structure of the light-harvesting chlorophyll a/b protein complex from plant chloroplasts

The light-harvesting chlorophyll a/b protein complex (LHC-II) is the major collector of solar energy in all plants and it binds about half of the chlorophyll in green plants. LHCII is a trimer in the photosynthetic membr
The light-harvesting chlorophyll a/b protein complex (LHC-II) is the major collector of solar energy in all plants and it binds about half of the chlorophyll in green plants. LHCII is a trimer in the photosynthetic membrane; each monomer consists of 232 amino acids, binds and orients a minimum of 12 chlorophyll molecules and three caroteinoids (two luteins and one neoxanthin) for light-harvesting and energy transfer. Although, the structure of LHC-II has been determined at 3.4 Å resolution by electron microscopy of two-dimensional crystals (Kühlbrandt et al., 1994), this is not sufficient to allow a complete understanding of the mechanism of energy transfer from LHC-II to the reaction centre, since the effective resolution in the z dimension is 4.9 Å. In fact, the chemical difference between Chl a and Chl b, which has a formyl group instead of the methyl group at the 7-position in the chlorin ring, is too small to be detected at this level of resolution. In addition, the orientation of the chlorophyll tetrapyrroles have not been determined unambiguously. This information is essential for a detailed understanding of the energy transfer within the complex and to the reaction centres of photosystem II and I (PSII and PSI). X-ray crystallography of three dimensional (3D) crystals may yield a more complete structure at high resolution. 3D crystals have been grown from LHC-II isolated from pea leaves using a standard purification procedure (Burke et al., 1978). The thylakoid membranes are solubilised in Triton X-100 and further purified by sucrose gradient ultra centrifugation. The LHC-II fraction is salt precipitated and pellets resuspended at the chlorophyll a/b ratio 2.8 mg/ml in 0.9 % Nonyl-glucoside. Crystals are currently obtained by vapour diffusion in hanging drops. These crystals are thin hexagonal plates, have a fairly large unit cell and diffract quite weakly. The high level of the background is due both to the detergent, necessary for protein solubilisation, and lipids, required for the trimer and crystals formation. However, three data sets, each from one single crystal have been collected up to 3.2 Å resolution over a rotation range of 135°. The crystals were exposed to a very highly collimated and brilliant beam (ID-14 EH1 at ESRF, Grenoble, France) and were kept under a stream of cold nitrogen to prevent radiation damage. Data were successfully integrated using the program XDS by Kabsch (1993). The crystals were found to belong to the space group P6 22 3 and have unit cell dimensions of a=128.45, b=128.45, c=135.32, a= ß=90º, ?=120. The solution of the phase problem was tackled by molecular replacement using, as a search model, the LHC-II structure solved by electron cryo-microscopy studies of twodimensional crystals (Kühlbrandt et al. 1994). Three different programs were tested: the most used AMoRe (Navaza et al., 1994) and the brute force based program Brute (Fujinaga
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Der Chlorophyll a und b bindende Lichtsammelkomplex II (LHC-II) ist der Hauptantennenkomplex höherer Pflanzen. Er dient der Lichtabsorption und Energieweiterleitung und bindet fast die Hälfte der Chlorophylle in grünen P
Der Chlorophyll a und b bindende Lichtsammelkomplex II (LHC-II) ist der Hauptantennenkomplex höherer Pflanzen. Er dient der Lichtabsorption und Energieweiterleitung und bindet fast die Hälfte der Chlorophylle in grünen Pflanzen. In der Thylakoidmembran liegt LHC-II als Trimer vor. Jedes Monomer besteht aus 232 Aminosäuren und bindet spezifisch mindestens 12 Chlorophyllmoleküle (Chl) und drei Carotinoide (zwei Luteine und ein Neoxanthin). Die Struktur von LHC-II wurde mittels Elektronenmikroskopie anhand von zweidimensionalen Kristallen mit einer Auflösung von 3.4 Å bestimmt. Diese Auflösung reicht jedoch nicht aus, um den Energieübertragungsmechanismus von LHC-II zu Photosystem II (PSII) zu verstehen, besonders da die tatsächliche Auflösung in der z- Dimension nur 4.9 Å beträgt. Der chemische Unterschied zwischen Chl a und Chl b besteht aus einer Formylgruppe anstelle einer Methylgruppe an der siebten Stelle des Chlorin-Rings und ist zu gering, um bei dieser Auflösung sichtbar zu werden. Zudem ist die Orientierung der Phorphyrinringe der Chlorophylle nicht eindeutig zu bestimmen. Diese Kenntnis ist jedoch wichtig für ein detailliertes Verständnis der Energieübertragung innerhalb des Komplexes und auf die Reaktionszentren von PSI und PSII. Um die Auflösung der Struktur zu verbessern und die EM Daten zu vervollständigen wurde Röntgenkristallographie an dreidimensionalen Kristallen (3D) durchgeführt. LHC-II wurde nach einem Standardprotokoll (Burge et al. 1978) aufgereinigt. Die in Triton X-100 solubilisierten Thylakoidmembranen wurden mittels eines linearen Saccharosegradienten aufgetrennt. Die fluoreszierende LHC-II Bande wurde mit KCl präzipitiert, gewaschen und in Nonyl-glucosid aufgenommen. Die Kristalle wurden mittels Dampfdiffusion in hängenden Tropfen erzeugt. Die Kristalle waren dünne hexagonale Platten, welche eine verhältnismäßig große Einheitszelle aufwiesen und schwach beugten. Die Kristalle waren zwischen 0.3 bis 0.4 mm groß und 10 bis 20 µm dick. Der hohe Hintergrund beruhte sowohl auf der Verwendung von Detergenz zur Solubilisierung des Proteins, als auch auf in der Präparation vorhandenen Lipiden. LHC- II bindet verschiedene Lipide: SQDG, MGDG, DGDG, PG und PC. Wie frühere Arbeiten gezeigt haben sind DGDG und PG für die 3D Kristallisation (Nußberger, 1994) notwendig, weshalb auf eine Entfernung der Lipide vor der Kristallisation verzichtet wurde. Die Datenaufnahme erfolgte an gefrorenen Kristallen um Strahlungsschäden zu verringern. Dies ermöglichte einen kompletten Datensatz über einen Rotationsbereich von 135º von einem einzelnen Kristall aufzunehmen. Insgesamt wurden 3 Datensätze mittels eines hoch kollimierten und brillianten Strahls (ID-14 EH1 am ESRF, Grenoble, Frankreich) mit einer Auflösung bis 3.2 Å aufgenommen. Die Datenanalyse erfolgte mittels des Programms XDS von Kabsch (1993). Dieses Programm verwendet einen R-faktor ( Rmrgd F . ) wie er in Diederichs
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Metadaten
Author:Matteo Lamborghini
URN:urn:nbn:de:hebis:30-0000002385
Referee:Bernd Ludwig
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2003/07/10
Year of first Publication:2002
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2002/08/23
Release Date:2003/07/10
HeBIS PPN:112489850
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

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