Molekulare Klonierung und Expression retroviraler chimärer Integrasen im proviralen Kontext des humanen Spumaretrovirus

Thema der vorliegenden Arbeit war der Austausch der retroviralen Integrase von HSRV gegen die Integrase von HTLV­1. Mit diesem Austausch sollte eine Steigerung der Integrationsrate von HSRV erreicht werden, um ihn als Ve
Thema der vorliegenden Arbeit war der Austausch der retroviralen Integrase von HSRV gegen die Integrase von HTLV­1. Mit diesem Austausch sollte eine Steigerung der Integrationsrate von HSRV erreicht werden, um ihn als Vektor für die Gentherapie zu optimieren. Zunächst wurde dazu die HTLV­1­Integrase im Austausch gegen die HSRV­ Integrase in HSRV eingebracht. Dieses rekombinante Plasmid war jedoch replikationsdefizient und hatte nach der Transfektion in eukaryonte Zellen keinen Virustiter. Dies führte zu der Überlegung, auch die für die Erkennung des Virus durch die Integrase wichtigen ersten 15 Nukleotide der LTR­Enden von HSRV an die Sequenz von HTLV­1 anzugleichen. Da auch der daraus resultierende Klon keine Infektiösität aufwies, konnte die Replikationsdefizienz eventuell weitreichendere Gründe haben als eine reine Integrationsdefizienz. Ein cis­Element am C­Terminus der HSRV­Integrase welches zur Stabilisierung und Verpackung der RNA in Partikel wichtige Funktionen hat, wurde daher in dem Klon mit der HTLV­1­Integrase regeneriert. Dazu wurde eine chimäre Integrase bestehend aus dem N­terminalen und dem Mittelteil der HTLV­1­Integrase mit dem C­terminalen Teil der HSRV­ Integrase fusioniert und in das HSRV Provirus mit und ohne die HTLV­1­LTR­Enden eingebracht. Da diese Klone ebenfalls nichtinfektiös waren, sollte Expressionsanalyse der rekombinanten Plasmide zur Klärung der Ursache ihrer Replikationsdefizienz beitragen. Als Kontrollen dienten dabei ein HSRV­Klon ohne Integrase, ein HSRV­Klon mit wiedereingeführter HSRV­Integrase und ein Konstrukt mit den HTLV­1­LTR­Enden aber mit der HSRV­Integrase. Die Untersuchung der chimären Klone ergab, daß virale genomische RNA zumindest kurze Zeit nach der Transfektion in den Zellen vorhanden war, aber eventuell nicht in Viruspartikel verpackt wurde, da vor der HTLV­1­Integrase ein weiteres ca. 114 Nt langes cis­Element fehlte. Dieses fehlende cis­Element war möglicherweise auch die Ursache für eine gestörte Gag­Prozessierung der Klone in 293T­Zellen. Da Gag­ Prozessierung für den Zusammenbau intakter Viruspartikel essentiell ist, konnte hier ein Grund für die Replikationsdefizienz der chimären Klone liegen. Alle weiteren viralen Proteine wurden von den chimären Klonen exprimiert und normal prozessiert. Die virale Protease war also enzymatisch aktiv. Weiterhin wurde die korrekte Aktivität der reversen Transkriptase nachgewiesen. Durch eine Kotransfektion der chimären Plasmide mit dem HTLV­1­Gag­Protein sollte das im Preintegrationskompex vorkommende Gag­Protein für die øTLV­1­ Integrase ersetzt werden. Auch dieser Versuchsansatz erwies sich als ungeeignet, die Integration bzw. Replikation der chimären Klone zu verbessern. Durch die Einklonierung eines Resistenzgens in die viralen Klone sollten Zellen mit integrierter viraler DNA gezielt selektioniert werden. Das Resistenzgen wurde in drei der viralen Konstrukte eingebracht, in wt­pHSRV13, in den Klon mit den HTLV­1­ LTR­Enden und der HTLV­1­Integrase sowie in das virale Plasmid mit den HTLV­1­ LTR­Enden und der chimären Integrase. Nach der Einzelzellselektion der mit wt­ Zeocin transfizierten BHK­Zellen hatte von sechs Klonen nur einer einen geringen Virustiter, dieser exprimierte als einziger virale Gene. Durch Southernblotanalyse dieser Einzelzellklone konnte die Anzahl der Integrate auf fünf bis acht pro Einzelzellklon ermittelt werden. Die Einzelzellklone aus der Transfektion mit den rekombinanten Klonen besaßen keine Infektiösität. Die Expression der viralen Gene war bei den Einzelzellklonen aus der Transfektion des Klons mit den HTLV­1­LTR­ Enden und der HTLV­1­Integrase nachweisbar.
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Metadaten
Author:Anja Doerks
URN:urn:nbn:de:hebis:30-0000000376
Referee:H. Zimmermann
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2003/05/07
Year of first Publication:2001
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2001/10/15
Release Date:2003/05/07
SWD-Keyword:Spumaviren ; Molekulargenetik
HeBIS PPN:102570892
Institutes:Biowissenschaften
Dewey Decimal Classification:610 Medizin und Gesundheit
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

$Rev: 11761 $